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小环DNA载体文献资料
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人内皮抑素小环载体的构建及其在真核细胞中的表达
[目的]构建表达人内皮抑素的小环DNA载体与普通质粒,并观察其在真核细胞中的表达.[方法]从pcDNA3.1(+)中扩增Pcmv和BGHpolyA片段,定向克隆于pSO72质粒中,构建成pSP72-Pcmv-BGHpolyA.将从pSP72-hEndostatin-IRES-EGFP质粒中酶切得到的hEndostatin-IRES-EGFP分别克隆到pSP72-Pcmv-BGHpolyA和pcDNA3.1(+),构建成pSP72-Pcmv-hEndostatin-IRES-EGFP-BGHpolyA(pSP72-hES)和pcDNA3.1-hEndostatin-IRES-EGFP(pcDNA-hES).对质粒pSP72-hES和pψC31分别做双酶切,体外连接,构建成pψ-hES.pψ-hES转化TOP10细菌后,通过介导分子内重组,降解细菌骨架,获取只含目的基因表达盒的小环DNA载体mc-hES.将mc-hES、pψ-hES、pcDNA-hES分别转染CNE2细胞48 h后,通过RT-PCR和Western blot观察其表达.[结果]构建的pψ-hES、mc-hES、pcDNA-hES序列正确,转染CNE2细胞后,3种质粒均有人内皮抑素蛋白的表达.[结论]成功构建了真核表达载体mc-hES、pcDNA-hES、pψ-hES,经转染细胞后在mRNA和蛋白水平证实有hEndostatin的表达,且小环组明显高于其他两组.在相同情况下,小环载体的表达强度优于传统的质粒载体.
