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血管紧张素Ⅱ上调人肾小球系膜细胞硬化相关基因的克隆
目的筛选和鉴定培养的人肾小球系膜细胞(MsC)在血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)作用下,产生以纤连蛋白(Fibronectin,FN)为代表的细胞外基质成分的过程中上调表达的基因,寻找AngⅡ致细胞外基质堆积作用的相关基因,为探讨AngⅡ在肾小球硬化发展过程的分子机制奠定基础.方法人MsC经AngⅡ(10-6mol/L)刺激24 h后,采用抑制性消减杂交(suppressionsubtractive hybridization,SSH)获得AngⅡ相关的差异表达的cDNA,经纯化克隆到pGEM-Teasy Vector并转化大肠杆菌;随机选择120个克隆,经反向Northern筛选上调表达的基因cDNA片段,并以Northern杂交验证,然后进行DNA序列测定和同源性比较.采用5'-和3'-RACE及长距离PCR的方法获得新基因的全长cDNA.结果在120个随机选择的克隆中,反向Northern结果表明有55个克隆表达明显上调.挑选其中20个克隆进行DNA序列测定,结果显示18个为独立的基因片段序列(有两个序列为双拷贝),其中15个为已知基因,包括细胞外基质成分:如血小板反应素Ⅰ、Ⅰ型胶原α2;细胞骨架及结合蛋白:如平滑肌肌动蛋白a钙调蛋白1、γ-胞浆型肌动蛋白等;合成和代谢相关蛋白:如醛缩酶A、延长因子1-γ、arnesyl pyrophosphate synthetase等;蛋白分解相关蛋白:如组织蛋白酶、泛素蛋白连接酶等.3个克隆(克隆104、52、46)与已知序列没有明显同源性,提示为新基因.3个新基因分别命名为AngRem(AngiotensinⅡrelated genein mesangial cells)104、AngRem52、AngRem46,GenBank登录号分别为AF367870、AY040225、AY040224.结论对已知基因的分析表明,AngⅡ对细胞外基质具有双重作用,即:既刺激培养的人MsC细胞外基质成分表达上调,也通过刺激PAI-Ⅰ等分子的表达而抑制细胞外基质成分的降解.此外,我们还发现了目前尚未报告的与AngⅡ对MsC的生物学效应-细胞外基质堆积和增生等作用相关的基因(包括3个新基因),为揭示AngⅡ介导的MsC在肾小球硬化进展过程的可能分子机制提供了新的线索.
