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家蚕蚕蛹变应原的鉴定、分离与纯化
目的鉴定、分离和纯化大造(Dazao)品系家蚕(Bombyx mori)的蚕蛹粗提液中的变应原蛋白质组分,为家蚕变应原的蛋白质组学和功能基因组学深入研究奠定基础.方法采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western-blotting,鉴定了家蚕蚕蛹粗浸液中变应原蛋白质分子,并通过阴离子交换和凝胶过滤层析分别对家蚕蚕蛹变应原蛋白质进行初步纯化.结果在家蚕蚕蛹粗浸液中含有表观分子量分别为80 000及30 000的蚕蛹变应原;从家蚕蛹全虫粗提液中初步分离到分子量为30 000的蛹变应原蛋白组分.结论分离得到的家蚕蚕蛹变应原蛋白组分可用于系统研究家蚕过敏原蛋白分子的蛋白质组学和功能基因组学.
关键词： 家蚕蚕蛹 过敏原 Western-blotting 离子交换层析 -
家蚕蚕蛹基因LOC101743840的原核表达、免疫学鉴定及生物信息学分析
目的 原核表达家蚕蚕蛹LOC 101743840(以下简称LOC)基因,鉴定LOC蛋白的免疫学特性,并进行生物信息学分析.方法 将合成的家蚕蚕蛹LOC基因(gil512917985)连接至克隆载体pMD18-T,用限制性内切酶Xho Ⅰ和BamH I分别对pMD18-T-LOC阳性质粒与原核表达载体pET-28a双酶切,构建重组表达质粒pET-28a-LOC并转化到E.coli BL21(DE3)中进行表达(经IPTG诱导);用Western blot鉴定重组LOC蛋白的免疫活性;用Clustalw2和MEGA5工具包分析LOC的基因;用ProtParam Tools预测LOC蛋白的理化性质;用PSIPRED和SWISS-MODEL预测其蛋白质结构.用IEDB、Preprod和DNAStar预测其细胞抗原表位.结果 成功表达了家蚕蚕蛹LOC基因,其开放阅读框768 bp,编码255组氨基酸;由E.coli BL21 (DE3)原核表达的重组LOC蛋白为可溶性,分子量约33 kD;Western bolt结果显示重组LOC蛋白可特异性结合家蚕蚕蛹过敏患者血清中的特异性IgE;家蚕蚕蛹LOC与脐橙螟LOC 106139919 (gil913330692)蛋白的同源性为69％.系统进化树显示家蚕蚕蛹与美国白蛾亲缘关系比较近.理化性质预测结果显示LOC蛋白质不稳定.蛋白质结构预测结果显示LOC主要的结构为无规则卷曲.T细胞抗原表位预测得到8个肽段(9-17、79-87、93-102、104-115、124-132、152-160、223-231和244-251).B细胞抗原表位预测得到个5肽段(34-49、59-74、127-142、202-217和213-228).结论 成功表达了家蚕蚕蛹LOC,并证实重组LOC蛋白具有良好的免疫活性,为进一步研究家蚕蚕蛹蛋白的结构成分、免疫学特性及理化性质提供了实验数据.
关键词： 家蚕蚕蛹 基因LOC101743840 原核表达 免疫学鉴定 生物信息学分析 -
家蚕蚕蛹过敏原表皮蛋白RR-2基序63前体(CPR63)的克隆表达、纯化鉴定及生物信息学分析
目的 克隆表达家蚕蚕蛹表皮蛋白RR-2基序63前体(CPR63)基因,纯化鉴定蛋白的过敏原性,并进行生物信息学分析.方法 合成家蚕蚕蛹CPR63蛋白的基因(ref|NM_001173223.1|),将其连接至克隆载体pMD 18-T,pMD18-T-CPR63阳性质粒与原核表达载体pET-44a分别用限制性内切酶酶切,构建出重组表达质粒pET-44a-CPR63,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达;Western blot检测重组CPR63蛋白特异性过敏原性;用clustalw2和MEGA5工具包进行同源性分析;用ProtParam Tools预测其理化性质;用PSIPRED和SWISS-MODEL预测其蛋白质结构.利用网络服务器IEDB、Preprod和DNAStar,对CPR63蛋白T、B细胞抗原表位进行预测.结果 经测序鉴定,本研究成功克隆出了家蚕蚕蛹CPR63基因,其开放阅读框549 bp,编码182组氨基酸.通过大肠杆菌E coli BL21 (DE3)表达CPR63重组蛋白主要以可溶性形式存在,相对分子质量约20000.Western blot显示重组CPR63能够与家蚕蚕蛹过敏患者血清IgE结合.家蚕蚕蛹CPR63蛋白与黑脉金斑蝶表皮蛋白RR-2基序63 (gb|EHJ69818.1|)同源性为85％.系统进化树结果显示家蚕蚕蛹与小菜蛾亲缘关系比较近.理化性质预测显示CPR63蛋白质较稳定.二级结构及三级结构预测结果显示CPR63的结构主要以无规则卷曲组成.T细胞抗原表位预测得到4个肽序列(5～13、20～28、51～59和87～95).B细胞抗原表位预测得到4个肽序列(21～40、37～56、47～66和64～83).结论 成功克隆并表达了家蚕蚕蛹CPR63,并证实重组CPR63蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究家蚕蚕蛹过敏原的结构成分及其理化性质奠定理论基础.
