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HCMV IE1和pp65在人神经胶质瘤U251细胞中的时序表达
目的:研究人神经胶质瘤U251细胞对人巨细病毒(human cytomegalovirus, HCMV)的容许性,并探讨病毒蛋白IE1及pp65的时序表达特点.方法:HCMV感染U251细胞,以透射电镜观察U251细胞的形态学改变,以PCR方法检测HCMV核酸,于不同的时间点分别用抗蛋白IE1及蛋白pp65单克隆抗体进行免疫细胞化学染色,检测IE1及pp65的表达水平.结果:受染的U251细胞出现了明显的形态学改变,并用PCR方法检测到了HCMV核酸.免疫细胞化学染色表明,蛋白IE1在感染后30min～2h无表达,4h开始表达,14h达高峰,随后下降;蛋白pp65在感染后1 h为入侵型pp65,4～96h一直呈低水平表达,至120h表达急剧升高.结论:U251细胞是HCMV的容许细胞,HCMV在其中的表达具有时序性,但是其时序表达较在人成纤维细胞中延迟.
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人巨细胞病毒IE1-GFP融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定
目的 构建增强型绿色荧光蛋白(GFP)与人巨细胞病毒(HCMV)IE1融合蛋白真核细胞表达载体,为IE1基因的表达和功能研究提供基础.方法 将质粒pNEB193-IE1和载体pEGFP-C1分别进行双酶切获得目的基因IE1片段和空载体,回收纯化后用T4连接酶将两者连接并转化E.coli JM109,用salⅠ、BamHⅠ双酶切后琼脂糖电泳鉴定阳性克隆.结果 双酶切pEGFP-C1-IE1后,琼脂糖电泳可见到大小约1476 bp的片段,与IE1预期片段大小一致,即IE1亚克隆入pEGFP-C1.结论 成功地构建了HCMV IE1-GFP融合蛋白真核表达载体pEGFP-C1-IE1.
关键词： 人巨细胞病毒(HCMV) IE1 GFP 真核表达 -
人巨细胞病毒IE1真核表达载体的构建与表达
目的 构建人巨细胞病毒(HCMV)IE1真核表达载体,观察其在真核细胞内的表达,为HCMV IE1核酸疫苗的相关研究奠定基础.方法 将质粒pNEB193-IE1用SalⅠ、BamHⅠ双酶切与载体pEGFP-C1连接构建重组载体pEGFP-C1-IE1;双酶切鉴定后,取重组载体pEGFP-C1-IE1用 EcoRⅠ、HindⅢ双酶切与载体pcDNA3.1(-)连接构建重组质粒pcDNA3.1(-)-IE1,双酶切和测序鉴定;将重组质粒pcDNA3.1(-) -IE1转染HeLa细胞,RT-PCR检测IE1 mRNA的表达.结果 重组载体pEGFP-C1-IE1和 pcDNA3.1(-)-IE1双酶切后均可切出约1 476 bp目的 片段;重组载体pcDNA3.1(-)-IE1测序结果登录GenBank,作BLAST分析,含有1 476 bp目的 基因片段,无碱基错配和移码突变,与读码框完全一致;转染重组载体pcDNA3.1(-)-IE1的细胞中可扩增出约1 476 bp的目的 条带.结论 成功地构建了真核表达载体pcDNA3.1(-)-IE1,且其能在真核细胞内表达.
关键词： 人巨细胞病毒(HCMV) IE1 表达 -
人巨细胞病毒IE1核酸疫苗的免疫效果研究
[目的]用人巨细胞病毒(HCMV)IE1核酸疫苗pcDNA3.1(-)-IEI免疫BALB/c小鼠,初步研究其产生的体液免疫和细胞免疫应答水平.[方法]将pcDNA3.1(-)-IE1通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠,通过PCR测定和免疫组化检测其在肌细胞中的表达,细胞因子测定、淋巴细胞转化实验检测免疫效果.[结果]PCR检测到与IE1大小一致的片段,免疫组化结果显示IE1基因在小鼠肌细胞中表达IE1目的蛋白.小鼠脾淋巴细胞经PHA刺激后,实验组IL-4、IL-2、IFN-γ含量以及淋巴细胞转化率显著增高,与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).[结论]1pcDNA3.1(-)-IE1核酸疫苗能在BALB/c小鼠肌细胞中稳定存在并能表达HCMV IE1蛋白,peDNA3.1(÷)-IE1核酸疫苗可诱导BALB/c小鼠脾细胞分泌IL-4、IL-2、IFN-r并刺激BALB/e小鼠脾细胞增殖.
关键词： 人巨细胞病毒(HCMV) IE1 疫苗 免疫应答
