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Ad-hNGFβ转染原代培养的大鼠脊髓星形胶质细胞及其生物活性研究
目的:体外培养新生SD大鼠脊髓星形胶质细胞,观察携带人β神经生长因子基因的重组腺病毒(Ad-hNGFβ)对其存活及毒性作用,为Ad-hNGFβ在体研究打下基础.方法:分离新生SD大鼠的脊髓星形胶质细胞(Astrocyte, Ast),应用DMEM/F-12 1:1培养基进行原代培养扩增鉴定.重组Ad-hNGFβ(MOI＝25,50,100)转染Ast后, 噻唑蓝(MTT)法检测病毒感染滴度与细胞存活的关系.ELISA方法测定培养3,6,9,12,15 d时培养上清中hNGFβ的含量;用流式细胞仪对转染细胞进行倍体分析,观察转染Ad-hNGFβ对细胞周期和凋亡的影响;Western blot印迹法测定转染后表达产物的存在形式.结果:从新生SD大鼠的脊髓组织中成功分离培养出星形胶质细胞,GFAP免疫荧光阳性.经MTT法测定,当MOI＝25,50,100时试验组的吸光值OD490与对照组比无显著差异,P＞0.05.转染Ad-hNGFβ后试验组细胞培养上清中hNGFβ表达量与对照组同期相比有显著差异,P＜0.01;且hNGFβ可持续表达至15 d.Ad-hNGFβ转染细胞后所表达的活性产物以hNGFβ二聚体的形式存在.流式细胞仪测得细胞增殖指数与对照组比明显升高,P＜0.01.结论:Ad-hNGFβ可有效介导hNGFβ基因转染原代培养的脊髓星形胶质细胞,并且成功表达有活性的hNGFβ,增加细胞活性.
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细菌体内同源重组构建pAdEasy-1-hNGFβ重组体
目的采用细菌内同源重组法高效制备含神经生长因子β基因(hNGFβ)的重组腺病毒质粒.方法 hNGFβ自载体pBLAST44-hNGFβv02中切出,亚克隆至质粒pBluescriptⅡsk(+)中,形成pBluescriptⅡsk(+)-hNGFβ,自pBluescriptⅡsk(+)-hNGFβ中酶切出hNGFβ DNA,亚克隆至腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中,形成转移质粒pShuttle-CMV-hNGFβ,在感受态大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组,得到重组腺病毒载体pAdEasy-1-hNGFβ.结果线性化的pShuttle-CMV-hNGFβ转化含pAdEasy-1的高效感受态大肠杆菌BJ5183,24 h后获得了30%阳性重组质粒克隆,经酶切获得大于20 kb的大片段和4.5 kb的特征性条带,PCR反应扩增出731 bp片段.结论应用细菌内同源重组能快速构建含hNGFβ基因的重组腺病毒载体pAdEasy-1-hNGFβ,为hNGFβ基因的研究及应用奠定了基础.
