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高分子迁移率族蛋白-1在肿瘤坏死因子-α诱导L929细胞程序性坏死中表达的作用
目的 建立小鼠成纤维(L929)细胞程序性坏死模型,探讨高迁移率族蛋白1(HMGB1)在其发生中的作用机制.方法 以小鼠重组肿瘤坏死因子(TNF)-α(rmTNF-α)(10 ng/ml)、泛半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)抑制剂z-VAD-fmk(10 μmol/L)、程序性坏死抑制剂Nec-1(30 μmol/L)处理L929细胞,建立程序性坏死模型.采用膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙锭(PI)双染流式检测细胞生存和死亡率;电镜观察细胞死亡形态;Western blot检测程序性坏死关键信号分子受体相互作用蛋白3(RIP3)/磷酸化混合系列激酶样结构域蛋白(pMLKL)及HMGB1在核内/胞质的改变,同时酶联免疫吸附试验(ELISA)检测胞外HMGB1水平;免疫共沉淀检测HMGB1与RIP3之间相互作用.结果 程序性坏死组PI阳性率明显增加,生存率下降[(32.76±2.00)％比(16.16±3.00)％;(61.77±3.00)％比(78.63％±3.50)％],抑制程序性坏死后PI阳性率明显下降,生存率上升[(1.76±0.50)％比(32.76±2.00)％;(96.73±7.00)％比(61.77±3.00)％].程序性坏死组RIP3/pMLKL的表达上调(t=71.085,P=0.000;t=58.314,P=0.000),抑制程序性坏死后RIP3/pMLKL表达下调(t=-23.620,P=0.000;t=-36.616,P=0.000).程序性坏死组核HMGB1的表达减少,胞质HMGB1表达增加,胞外HMGB1增加(t=-41.299,P=0.000;t =56.667,P=0.000;t=63.319,P=0.000),抑制程序性坏死后,胞外HMGB1减少(t=-31.095,P=0.000).程序性坏死组HMGB1与RIP3结合减弱,抑制程序性坏死后HMGB1与RIP3结合增强(t=-20.201,P=0.000;t=18.529,P=0.000).结论 TNF-α联合z-VAD-fmk可诱导L929细胞程序性坏死,HMGB1从核内释放至胞质,通过被动方式释放至胞外,发挥其相关致炎作用.同时胞质HMGB1通过与RIP3相互作用可能对程序性坏死起到负向调控作用.
关键词： 高分子迁移率族蛋白-1 程序性坏死 受体相互作用蛋白3
