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Cre/loxP位点特异性重组系统文献资料
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携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体的构建与结构鉴定
目的 构建携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体,优化目前的肝细胞永生化.方法 去除eGFP终止子taa的pSEB-HUS质粒为逆转录病毒基础质粒.先将SV40T及其启动子hEFH亚克隆至pSEB-HUS,再将LoxP位点插入至pSEB-SV40T质粒的抗性基因Blasticidin上游获得pSEB-LoxP-SV40T质粒.同时将CD自杀基因定向克隆至pSEB-HUS的eGFP下游;然后设计一段HSV-tk自杀基因引物,在上游引物的5'端加入方向一致的LoxP序列.PCR获得TK基因后,定向克隆至CD下游获得pSEB-CD-TK,后将pSEB-CD-TK上的双自杀基因亚克隆至pSEB-LocP-SV40T质粒上得到携带双自杀基因及SV40T的质粒.结果 PCR及酶切鉴定均证实两个自杀基因及SV40T正确克隆至逆转录病毒质粒中,目的基因序列与GenBank报道一致,两个LoxP位点方向相同.结论 成功构建携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体.
