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创伤修复与再生文献资料
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大鼠毛囊干细胞的体外培养及相关检测的实验研究
目的:建立体外分离培养、扩增、鉴定大鼠毛囊干细胞(rat hair follicle stem cells,rHFSCs)的方法,观察其生物学特性.方法:切取1周龄SD大鼠触须部皮肤,用Dispase酶和Ⅳ型胶原酶混合液消化,显微镜下分离毛囊隆突部,用组织块法培养rHFSCs,培养基为DMEM/F12基础培养基,加不同浓度的KSR血清替代物、青链霉素混合液、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、EGF、bFGF、羟基乙醇和氢化可的松.用Ⅳ型胶原差速贴壁法纯化rHFSCs,再通过细胞免疫荧光染色及QPCR检测相关基因来联合鉴定,分别取不同代rHFSCs检测细胞增殖能力和活力.结果:以上方法分离、培养、纯化的HFSCs呈典型的铺路石状,贴壁较牢,克隆形成能力强.免疫细胞化学鉴定可见角蛋白15(Keratin-15,Krt15)、整合素α6(Integrin-α6,Itgα6)和整合素β1(Integrin-β1,Itgβ1)抗体表达呈阳性.纯化后的细胞初2～3d细胞处于生长的潜伏期,5～6d时细胞处于对数生长期;从第7代开始,随着传代次数的增加,细胞活力也明显下降.Q-PCR检测发现,经过全新的培养体系得到的干细胞活性大,拥有较强的增殖能力,几乎不合有表皮角质形成细胞.结论:改进的显微镜联合组织块法分离培养rHFSCs,经Ⅳ型胶原差速贴壁法筛选后,可得到高纯度的rHFSCs,细胞增殖能力强,可以为干细胞组织工程学构建人工毛囊、血管及皮肤等提供良好的种子细胞.
