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p75NTR受体过表达对人RPE细胞氧化应激损伤的促进作用
背景 脉络膜新生血管(CNV)是多种眼底疾病致盲的病理基础,视网膜色素上皮(RPE)细胞氧化应激损伤在CNV生成中具有重要作用.RPE氧化应激损伤能激活肿瘤坏死因子超家族的p75NTR受体,引起血管内皮细胞增生,但其调控机制尚未明确.目的 探讨RPE细胞中p75 NTR受体在CNV形成过程中的作用,并对其作用机制进行分析.方法 体外培养人RPE细胞(ARPE19细胞系),用p75 NTR受体过表达质粒转染RPE细胞,分别采用逆转录PCR(RT-PCR)和Western blot法进行转染细胞中p75NTR受体基因和蛋白水平检测,以未转染p75 NTR受体过表达质粒的RPE细胞作为对照组.采用BrdU法检测各组细胞的增生活性;采用Annexin V-FITC/PI双染法及流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率;用H2DCFDA荧光法和流式细胞计数检测细胞内活性氧簇(ROS)阳性百分数;采用激光扫描共焦显微镜观察各组细胞线粒体标志物的表达(膜电位)及细胞色素C的表达;采用Western blot法检测和比较各组细胞中裂解caspase-3、Fas及血管内皮生长因子165(VEGF165)蛋白的相对表达水平.结果 p75NTR受体质粒转染组细胞中p75 NTR受体的mRNA及蛋白表达量分另是对照组的(6.11±0.77)倍和(7.42±0.48)倍,差异均有统计学意义(t=11.49、23.17,均P＜0.01).BrdU法检测结果显示,p75NTR受体质粒转染12、24、36和48 h组细胞的增生活性(A值)率分别为(93.12±0.56)％、(86.30±0.66)％、(72.53±0.86)％和(60.77±2.81)％,对照组为100％,随着p75NTR受体质粒转染时间的延长,RPE细胞活性值逐渐减低,细胞凋亡百分数明显增加,与对照组比较差异均有统计学意义(均P＜0.05).p75NTR受体质粒转染组转染后48 h,RPE细胞内ROS相对荧光强度为对照组的2.4倍,差异有统计学意义(t=16.45,P＜0.01);对照组RPE细胞中线粒体标志物阳性细胞比例为100％,而p75 NTR受体质粒转染组细胞中线粒体标志物阳性细胞比例为(37.30±2.06)％,2个组比较差异有统计学意义(t=57.71,P＜0.01).p75NTR受体质粒转染组RPE细胞中细胞色素C的荧光强度明显高于对照组,与对照组比较,p75NTR受体质粒转染组RPE细胞中裂解caspase-3、Fas及VEGF165蛋白表达水平明显升高,差异均有统计学意义(均P＜0.01).结论 p75NTR受体过表达引起RPE细胞线粒体损伤及细胞凋亡,同时刺激RPE细胞分泌血管生成因子,促进CNV的形成.p75NTR受体可能是调控RPE损伤的另一个重要通路.
