首页 > 文献资料
-
弓形虫SAG1基因截短片段植物表达载体的构建
目的将弓形虫SAG1基因截短片段(t-SAG1),分别用植物组成型E35S启动子和番茄果实特异性E8启动子驱动,构建t-SAG1植物表达载体.方法自本室构建的pET32a-t-SAG1载体中PCR扩增得到t-SAG1基因,克隆进T载体为pMD-T-t-SAG1,酶切鉴定后进行测序确认.用BamHⅠ单酶切连接方式将t-SAG1分别亚克隆进pB35MG、pB35E1MG、pBE2MG载体,分别构建中间载体pB35-t-SAG1、pB35E1-t-SAG1、pBE2-t-SAG1载体.其中,pB35-t-SAG1以E35S驱动t-SAG1,3′端携带NOS3′终止子序列,组成 E35S/t-SAG1/NOS3′操纵子结构单元.pB35E1-t-SAG1含E35S和番茄果实特异性E8启动子核心序列E81.1双启动子驱动t-SAG1,组成E35SE81.1/t-SAG1/NOS3′操纵子结构单元.pBE2 t-SAG1以番茄果实特异性E8启动子全长E82.2驱动t-SAG1,组成E82.2/t-SAG1/NOS3′操纵子结构单元.pB35-t-SAG1、pB35E1-t-SAG1、pBE2-t-SAG1经酶切证实后,分别将其中E35S/t-SAG1/NOS3′、E35S-E81.1/t-SAG1/NOS3′、E82.2/t-SAG1/NOS3′操纵子结构单元以HindⅢ单酶切连接方式亚克隆进pCAMBIA2300质粒中,构建植物表达载体pC35-t-SAG1、pC35E1-t-SAG1、pCE2-t-SAG1,酶切鉴定.含三种启动子驱动t-SAG1的植物表达载体转化根癌农杆菌LBA4404感受态细胞后, PCR鉴定农杆菌中的t-SAG1.结果重组质粒用酶切鉴定均得到预期大小片段;CR鉴定转化入根癌农杆菌LBA4404的t-SAG1基因扩增得到预期700bp大小片段;pMD-T-t-SAG1测序结果表明t-SAG1基因序列完全正确,读码框正确.结论成功构建t-SAG1中间载体pB35-t- SAG1、pB35E1-t-SAG1、pBE2-t-SAG1,以及植物表达载体pC35-t-SAG1、pC35E1-t-SAG1、pCE2-t-SAG1,并将三种植物表达载体成功导入根癌农杆菌,为弓形虫转基因番茄口服疫苗的研究奠定了基础.
关键词： 刚地弓形虫 SAG1基因截短片段 番茄果实特异性启动子 植物表达载体
