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牛膝多糖对硝普钠诱导的兔关节软骨细胞凋亡的影响及机制研究
目的 研究牛膝多糖(ABPS)对硝普钠诱导的兔软骨细胞凋亡的影响及可能机制.方法 取新西兰白兔膝关节软骨建立兔软骨细胞体系,分别用白芦藜醇、尼克酰胺及不同浓度ABPS(200、300、400μg/ml)处理经硝普钠诱导凋亡后的P3代软骨细胞.采用流式细胞仪检测细胞凋亡率.采用RT-PCR法检测烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)、信息沉默因子1(Sirt1)、p53和Bax mRNA表达水平.结果 与硝普钠组比较,白芦藜醇组、ABPS各组软骨细胞凋亡率均明显下降(均P＜0.05),而尼克酰胺组软骨细胞凋亡率明显上升(P＞0.05).与ABPS 200μg/ml组比较,ABPS 300μg/ml组及ABPS 400μg/ml组软骨细胞凋亡率明显下降(均P＜0.05).ABPS可上调抗凋亡基因NAMPT、Sirt1 mRNA表达,同时使凋亡基因p53、Bax mRNA表达下调,并且浓度300μg/ml时效果明显.结论 ABPS可能通过激活NAMPT、Sirt1来抑制p38信号通路下游的关键基因p53,对软骨细胞凋亡起保护作用.
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兔关节软骨细胞的体外培养及凋亡相关基因在传代细胞中的表达
目的 验证体外Ⅱ型胶原酶消化法培养兔软骨细胞的可行性,探讨凋亡及抗凋亡基因在软骨细胞传代中的变化,寻找关节软骨退变老化研究的适宜靶细胞.方法 在无菌条件下取6周龄新西兰大白兔双侧膝关节软骨,采用Ⅱ型胶原酶消化并机械吹打的方法分离关节软骨细胞并进行原代、传代培养;形态学观察时采用甲苯胺蓝染色法对关节软骨细胞进行鉴定;RT-PCR法检测P0～P4代软骨细胞烟酰胺磷酸核糖转移酶[NAMPT)、信息沉默因子1(Sirt1)、p53、Bax基因的mRNA相对表达量,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各代关节软骨细胞增殖情况.结果 显微镜下观察兔原代软骨细胞大多呈透亮椭圆形、短梭形、多角形特征,72h全部贴壁生长.甲苯胺蓝染色显示培养的软骨细胞细胞质染成浅蓝色,细胞核染成深蓝色;前3代软骨细胞表型稳定,增殖力良好;连续培养至P4代后,绝大部分细胞变为长梭形和不规则形状.随着软骨细胞的传代,NAMPT的表达量逐渐下调.与P0代软骨细胞相比,Sirt1的表达量在P1代细胞中明显上调,在P2代细胞急剧下降至P0代以下,在P3～P4代细胞中Sirt1的表达量逐渐下调.凋亡基因p53和Bax的表达量随着软骨细胞的传代而上调.前3代软骨细胞增殖差异无统计学意义(均P＞0.05);在培养到第4～7天时,P1～P3代与P4代软骨细胞增殖差异有统计学意义(P＜0.05).结论 采用体外Ⅱ型胶原酶消化法培养兔关节软骨细胞是切实可行的.随着软骨细胞的传代,抗凋亡基因NAMPT、Sirt1的表达逐渐下调,凋亡基因p53、Bax的表达逐渐上调.P1～P3代关节软骨细胞作为研究关节软骨凋亡的细胞体系是合适的.
关键词： 软骨细胞 体外培养 烟酰胺磷酸核糖转移酶 信息沉默因子1 传代
