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人细小病毒B19中国株结构蛋白VP1的克隆及表达
目的:构建人细小病毒B19中国株结构蛋白VP1基因片段的重组表达载体,探索大量表达VP1蛋白的佳条件. 方法:从该科保存的人细小病毒B19中国株结构蛋白VP1基因片段的重组克隆载体中获得VP1基因片段,将该片段亚克隆入表达载体pQE 30,构建VP1- pQE 30原核表达载体,并转化至感受态大肠杆菌M15中,给予不同浓度诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)及在不同温度下进行诱导表达. 结果:成功构建了融合蛋白VP1- pQE 30的重组表达质粒,表达的融合蛋白经15%SDS-PAGE电泳证实其相对分子质量为22000.IPTG浓度为1 mmol/L,诱导表达5 h,37℃下无表达,25℃下有表达;采用不同的IPTG浓度诱导表达5 h,0.05 mmol/L至1 mmol/L均有表达,表达率相近,为(16±1)%. 结论:获得人细小病毒B19 中国株结构蛋白VP1基因片段的原核表达载体及其产物, 对进一步研究其纯化及制备单克隆抗体和疫苗有重要意义.
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人细小病毒B19VP1基因片段原核表达载体的构建及其表达
目的克隆人细小病毒B19 VP1基因片段,构建其重组克隆载体和表达载体,并诱导表达.方法利用聚合酶链反应(PCR)和分子克隆技术,将B19病毒VP1基因片段扩增后,构建pGEM-T-easy克隆载体;经PCR筛选后,亚克隆于pGEX-4T-1表达载体中,并转化至BL21感受态菌;经诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并以免疫印迹法对表达蛋白进行鉴定.结果扩增出一条约801bp的基因片段,PCR鉴定结果的与预期结果一致.经IPTG诱导,VP1融合蛋白在大肠杆菌中得到成功表达,PAGE上出现相对分子量约为54KD的一条新生蛋白带,经蛋白印迹验证为表达蛋白B19VP1.薄层扫描现示,表达产物占菌体总蛋白的27.4%.结论获得人细小病毒B19VP1基因片段的原核表达载体及其产物,对进一步研究其纯化及B19疫苗有重要意义.
