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心肌成纤维细胞成为基因靶细胞的可行性研究
目的探索心肌成纤维细胞成为基因靶细胞的可行性.方法采用改良的差速贴壁法培养乳鼠心肌成纤维细胞并加以鉴定;利用携带新霉素抗性基因(neor)的假型逆转录病毒载体(VSV-G/MuLV)转导培养的乳鼠心肌成纤维细胞,用G418筛选法观察基因转导效果.结果成功建立高纯度心肌成纤维细胞培养模型;转基因后的心肌成纤维细胞经G418筛选后2周左右见大量克隆形成.结论假型病毒载体成功介导neor基因转导入心肌成纤维细胞,表明心肌成纤维细胞有望成为心血管疾病基因治疗的靶细胞.
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转tPA基因血管内皮细胞的功能表达
目的观察组织型纤溶酶原激活剂(tPA)基因转导血管内皮细胞后的功能表达.方法利用携带tPA基因的假型逆转录病毒转导血管内皮细胞株ECV304,用G418筛选法观察基因是否成功转导,采用发色底物显色法检测转基因ECV304细胞培养上清液中tPA纤溶活性变化.结果转tPA基因后的血管内皮细胞经G418筛选后2周左右见大量克隆形成;转tPA基因ECV304细胞培养上清液中tPA纤溶活性在转导24 h后增高,48h后增高更明显,72～96 h浓度达高峰.结论假型逆转录病毒载体成功介导tPA基因转导血管内皮细胞,并呈有效功能表达,为心血管手术后预防血栓形成的基因治疗提供实验依据.
关键词： 假型逆转录病毒 组织型纤溶酶原激活剂 血管内皮细胞 基因 -
新型假型逆转录病毒载体的构建
目的将疱疹性口炎病毒壳G糖蛋白(VSV-G)用于构建新型假型逆转录病毒载体(VSV-G/MuLV).方法利用三质粒系统一过性转染293T/17细胞,通过磷酸钙共沉淀法产生VSV-G/MuLV;一过性转染后的病毒上清转导包装细胞系293/GPG以产生VSV-G/MuLV生产细胞系.G418筛选未成功转导的细胞,经筛选后的293/GPG细胞生产VSV-G/MuLV;用病毒上清转染NIH3T3细胞,并采用G418克隆筛选法测定病毒滴度.结果感染后的NIH3T3细胞在G418的筛选培养下,有大量克隆形成,经计数和计算,VSV-G/MuLV病毒上清滴度为6×106.结论成功构建了VSV-G/MuLV;该型病毒转染效率高,可直接转导大多数细胞,在有效监控条件下,VSV-G/MuLV作为载体可用于基因治疗.
