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人突触核蛋白文献资料
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胞质定位和核定位突触核蛋白慢病毒表达载体的构建
目的:构建表达人突触核蛋白(α-synuclein)核定位和胞质定位基因(SNCA-NLS和SNCA-NES)的真核细胞表达慢病毒载体,并且观察重组质粒在293FT细胞中的表达情况.方法:采用PCR 方法从质粒中扩增出目的基因,扩增出的目的基因与线性化后的载体PLVU-2A-EGFP在In-fusion重组酶作用下通过同源重组把目的片段连接到空载体上.目的片段和EGFP报告基因之间通过自剪切多肽2A 连接.对重组质粒进行PCR、双酶切和质粒测序鉴定后,采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000 将重组的质粒转染至293FT细胞中,用荧光显微镜检测基因在细胞中表达的情况.通过蛋白质印迹分析核定位和胞质定位基因(SNCA-NLS和SNCA-NES)在胞核和胞质中突触核蛋白的定向表达.结果:PCR、双酶切和质粒测序结果证明SNCA-NLS和SNCA-NES已正确地克隆到真核表达载体PLVU-2A-EGFP中,并分别在细胞核和细胞质中定向表达.结论:成功构建了PLVU-SNCA-NLS-2A-EGFP及PLVU-SNCA-NES-2A-EGFP表达载体,为研究α-突触核蛋白在帕金森病发病过程中所起的作用奠定了基础.
