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幽门螺杆菌IV型分泌系统cagX基因缺失株的构建与鉴定
目的:构建幽门螺杆菌(H.pylori,Hp)IV型分泌系统cagX基因缺失株,为研究cagX基因的功能奠定基础.方法:利用基因同源重组原理,设计cagX基因上下游同源臂片段,应用PCR扩增目的基因片段,TA克隆后酶切鉴定,将纯化后的同源臂片段连接到含卡那霉素抗性基因的载体pBluescript SKⅡ(-),即cagX基因自杀质粒pBlueKM40-ΔcagX;自杀质粒电击转化Hp NCTC 11637,通过卡那霉素筛选基因缺失株,后经 PCR和DNA测序鉴定.结果:构建成功了幽门螺杆菌cagX基因自杀质粒,并转化至Hp NCTC 11637内.结论:成功获得了幽门螺杆菌cagX基因缺失株Hp 11637-ΔcagX.
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布鲁氏菌的IV型分泌系统
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的人兽共患病,给养殖业、人类健康和动物源性食品安全带来很大威胁.布鲁氏菌的IV型分泌系统在布鲁氏菌的致病力上发挥重要作用,与布鲁氏菌在宿主细胞内生存、复制有密切关系.IV型分泌系统由virB操纵子编码,由同一启动子调控,是一个多蛋白的跨膜复合物,受感染宿主细胞类型、生长温度、营养条件、pH值等多因素调控;并且对布鲁氏菌的胞内、胞外的生存产生重要影响.
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重组表达幽门螺杆菌致病岛CagL蛋白及其中和抗体初步研究
目的 重组表达幽门螺杆菌(Helicobacterpriori,Hp)cagL基因,并制备兔抗多克隆抗体及阻断Hp黏附宿主细胞实验.方法 用PCR方法 扩增出cagL基因片段,将目的 基因构建至表达载体pET22b中并诱导表达.采用亲和层析法纯化蛋白,以纯化蛋白为抗原免疫家兔,制备兔抗CagL多克隆抗体血清,并用多克隆抗体血清进行阻断坳黏附宿主细胞实验及细胞因子IL-8活性分析.结果 成功构建表达纯化了CagL重组蛋白,制备CagL蛋白兔抗多克隆血清,并初步验证了多克隆抗体血清在体外和Hp黏附作用的关系.与对照菌相比,重组菌CagL在25 X 103.附近均出现新的蛋白表达条带,且诱导6 h时表达量高.UVP扫描分析目的 蛋白占菌体总蛋白的35%～40%.SDS-PAGE显示重组蛋白CagL主要以包涵体形式存在于超声沉淀中.ELISA结果显示兔抗CagL多克隆抗体的滴度为1:16 000 EU.Giemsa染色后显微镜观察可见坳菌与HeLa细胞呈典型的聚集性黏附,抗体中和后Hp与HeLa细胞未见黏附,加入DH5α的HeLa细胞也未见细菌黏附.结论 多克隆抗体血清对Hp黏附定植有一定阻断作用,并且可以减少Hp促进细胞分泌IL-8的能力.
