您当前的位置：
首页 > 文献资料
所属专业：
酰基CoA连接酶文献资料
-
酰基CoA连接酶DptE及其突变体DptE-296的克隆、初步分离纯化与鉴定
通过PCR方法扩增达托霉素生物合成相关的酰基CoA连接酶DptE及其突变体dptE-296的基因片段,经限制性内切酶bamHⅠ和Xho Ⅰ双酶切后插入到原核表达载体pet22b,利用质粒自带的氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,并进行菌液PCR和测序鉴定;将测序正确的重组质粒通过热击法转入BL21(DE3)表达菌株,IPTG诱导蛋白表达,渗透压休克法提取周质蛋白,镍柱亲和纯化,通过SDS-PAGE,Western blot鉴定蛋白表达;连接生物素,通过Fortebio检测蛋白和底物癸酸的结合.测序结果显示成功构建重组载体DptE-pet22b和DptE-296-pet22b,SDS-PAGE和Western blot结果显示表达产生的蛋白大小与预期一致,Fortebio实验显示DptE及其突变体DptE-296对底物癸酸有结合,但结合的不强.
