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基因打靶技术及其在寄生虫学研究中的应用
基因打靶是近年来发展起来的现代分子生物学重要的实验技术之一.其原理是通过外源性DNA与细胞内基因组DNA同源序列可发生重组这一性质,人为地定点修饰改造基因组中某些基因的结构和组成,以研究该特定基因在活体中的功能或相关疾病的致病机理.本文仅就该技术的原理和基本操作以及该技术在寄生虫学研究中的应用和进展作一介绍.
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表达人CD40配体的重组腺病毒载体的构建
目的构建含有hCD40L基因的重组腺病毒载体,为其在动物模型体内表达和肿瘤基因治疗提供基础.方法用XhoⅠ、SwaⅠ双酶切质粒pORF-hCD40L,回收1 900bp基因片段并定向克隆插入穿梭质粒pShuttle中XhoⅠ、EcoRV双酶切位点,得到重组质粒pShuttle-hCD40L.经PmeI酶切与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,同源重组后用选择培养基筛选阳性克隆,提取质粒PacI酶切线性化后用脂质体介导转染293细胞.酶切分析和PCR鉴定重组的腺病毒.结果酶切分析、KR验证表明,hCD40L基因成功克隆到腺病毒pAdEasy-1载体中.结论成功构建表达hCD40L基因的重组腺病毒载体,为进一步研究其在哺乳动物内表达及基因治疗提供了基础.
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小鼠CD40L重组腺病毒载体的构建
目的:构建含有小鼠CD40L基因的重组腺病毒载体,为研究mCD40L的生物学特性及肿瘤基因治疗提供基础.方法:用XhoI、SwaI双酶切质粒pORF-mCD40L,回收1955bp基因片断并定向克隆插入穿梭质粒pShuttle中XhoI、EcoRV双酶切位点,得到重组质粒pSh-mCD40L.经PmeI酶切与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化BJ5183细菌,同源重组后用选择培养基筛选阳性克隆,提取质粒PacI酶切线性化后用脂质体介导转染293细胞.14天左右观察细胞病变及PCR鉴定重组的腺病毒.结果:酶切分析、PCR验证mCD40L基因克隆到腺病毒pAdEasy-1载体中.结论:成功构建表达mCD40L基因的重组腺病毒载体,为进一步研究其功能和基因治疗提供了基础.
