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猪圆环病毒1型文献资料
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乙型脑炎减毒活疫苗中猪圆环病毒PCR检测方法的建立及验证
目的 建立乙型脑炎减毒活疫苗中猪圆环病毒1型(porcine circovirus 1,PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)PCR检测方法,并进行验证及初步应用.方法 参照GenBank中登录的PCV1(AY193712)及PCV2序列(AY181946)设计引物,以提取的PCV1和PCV2基因组DNA为模板,分别经PCR扩增726 bp的PCV1片段和433 bp的PCV2片段,并对PCR反应中的退火温度、引物浓度、Mg2+浓度参数进行优化.将PCR扩增产物分别与pMD 18-T载体连接,连接产物转化感受态大肠埃希菌DH5α,挑取阳性克隆,测序并进行同源性分析.对优化的PCR方法进行灵敏度和特异性验证,并用该方法检测3批乙型脑炎减毒活疫苗工作种子批、4批明胶和10批胰蛋白酶中的PCV1和PCV2.结果 确定PCR反应的退火温度为54℃,引物浓度为10 μmol/L,Mg2+浓度为10 mmol/L.扩增的目的基因测序结果与GenBank中发布的PCV1及PCV2序列的同源性均为100％.建立的PCR方法低可检出10 pg的目的基因;该方法只对PCV1和PCV2基因组DNA能扩增出特异性条带.用该方法检测乙型脑炎减毒活疫苗工作种子批、明胶和胰蛋白酶,均未检出PCV1和PCV2.结论 成功建立了乙型脑炎减毒活疫苗中PCV1和PCV2的PCR检测方法,该方法具有较高的灵敏度和较强的特异性,可用于乙型脑炎减毒活疫苗工作种子批及两种猪源性原材料的PCV1和PCV2污染检测.
