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生长激素释放激素受体剪接变异体 1文献资料
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GHRHR-SV1抗体的制备及其蛋白在黑色素瘤细胞中的表达
目的：制备生长激素释放激素受体剪接变异体1（GHRHR-SV1）抗体，并检测 GHRHR-SV1蛋白在黑色素瘤细胞中的表达情况，为后续的肿瘤机制研究奠定基础。方法：设计 GHRHR-SV1基因序列，将其插入质粒 pET-32a （＋）中，构建 pET-GHRHR-SV1重组载体，经 PCR 及测序鉴定后，转入大肠杆菌 BL21（DE3）中，分别加入0、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol·L－1异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）；诱导1、2、4和6 h，并在37℃、30℃和25℃不同温度下进行诱导；观察目的蛋白表达的佳 IPTG浓度、时间和温度。亲和层析纯化重组蛋白，将纯化后的蛋白免疫家兔，制备兔多克隆抗体， ELISA法检测该抗体效价， Western blotting法检测 GHRHR-SV1蛋白在黑色素瘤细胞系 B16-F10中的表达情况。结果：重组载体 pET-GHRHR-SV1构建成功。在 IPTG浓度为2.0 mmol· L－1时目的蛋白的表达量高；IPTG诱导蛋白表达2 h时，蛋白表达量大；当温度为25℃时，蛋白的表达量大。诱导表达的蛋白相对分子质量约为24000，纯化后纯度为80％， GHRHR-SV1抗体效价为1∶1600000，B16-F10细胞中有 GHRHR-SV1蛋白表达。结论：成功制备 pET-GHRHR-SV1重组载体。GHRHR-SV1蛋白在 IPTG浓度为2.0 mmol·L－1、诱导时间为2 h和温度为25℃的条件下表达佳。成功制备了高效价的 GHRHR-SV1抗体。黑色素瘤细胞系中有 GHRHR-SV1蛋白表达。
关键词： 生长激素释放激素受体剪接变异体 1 重组载体 重组蛋白 抗体 黑色素瘤
