首页 > 文献资料
-
自噬相关基因Atg4 B及LC3－Ⅱ在肌萎缩侧索硬化症转基因鼠海马中的表达及意义
目的：观察自噬相关基因Atg4B及LC3－Ⅱ在肌萎缩侧索硬化症（ALS）转基因鼠海马组织中的表达变化，探讨细胞自噬机制在ALS发病中的作用及意义。方法选择SOD1－G93A转基因鼠进行试验，分别于发病早、中、晚期，通过 RT－PCR、免疫荧光检测小鼠海马组织中 Atg4B、LC3－Ⅱ在mRNA、蛋白水平的表达及变化。结果与野生型鼠相比较，转基因鼠的 Atg4 B在 mRNA及蛋白水平表达均下调；LC3－Ⅱ在蛋白水平表达上调，在mRNA水平变化不明显。结论自噬相关基因Atg4B及LC3－Ⅱ参与了ALS发病，ALS海马组织的病变与自噬异常有关。
-
自噬相关蛋白ATG4 B抑制剂的虚拟筛选及体外活性测定
目的 通过计算机虚拟筛选和体外活性测定,筛选自噬相关蛋白ATG4B的特异性小分子抑制剂.方法 基于ATG4B蛋白的晶体结构(PDB ID:2CY7)找出合适的对接口袋;用分子对接方法对SPECS数据库20万化合物进行虚拟筛选并确定候选化合物;用荧光共振能量转移方法(FRET)检测候选化合物对ATG4B的体外抑制活性并对其特异性进行验证.结果 确定受体蛋白2CY7的site 5为适的对接口袋;分子对接后经综合分析选择并购买30个代表性化合物做进一步活性测定.活性测定结果显示,AG-690/10400046能有效抑制ATG4B蛋白的活性,而对半胱氨酸蛋白酶家族的另一成员caspase-3无酶切抑制作用.结论 建立了一种ATG4B蛋白抑制剂的虚拟筛选方法.筛选得到的化合物AG-690/10400046具有明显的体外抑制活性,为后续ATG4B抑制剂的生理功能研究奠定基础.
-
丙戊酸钠通过激活miR-34c-5p/ATG4B信号通路抑制SH-SY5Y细胞自噬
目的 探讨丙戊酸钠(VPA)对SH-SY5Y细胞中miR-34c-5p/ATG4B信号通路的激活作用及对自噬的影响.方法 人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y用含10％胎牛血清的DMEM培养基常规培养,然后使用不同剂量VPA处理SH-SY5Y细胞24 h,采用定量PCR分析VPA处理对ATG4B mRNA与miR-34c-5p表达的影响,免疫印迹法分析VPA处理对ATG4B蛋白表达的影响,将含ATG4B启动子片段的报告质粒转染SH-SY5Y细胞,然后通过荧光素酶报告基因系统分析VPA处理对ATG4B启动子活性的影响,用VPA单独或联合转录抑制剂放线菌素D分别处理SH-SY5Y细胞不同时间,定量PCR分析检测不同处理对ATG4B mRNA稳定性的影响,用VPA单独或联合miR-34c-5p抑制剂处理细胞24 h,通过检测不同处理对ATG4B表达变化的影响,进而判断miR-34c-5p在VPA下调ATG4B表达中的作用,同时通过Western blot检测不同处理对LC3-II表达的影响,分析细胞自噬水平变化.结果 VPA可剂量依赖性降低SH-SY5Y细胞中ATG4B的mRNA和蛋白水平(P<0.05).VPA处理不影响SH-SY5Y细胞中ATG4B的启动子活性(P>0.05),但显著下调其mRNA的稳定性(P<0.05).同时,VPA处理明显增强SH-SY5Y细胞中miR-34c-5p的表达水平(P<0.05).使用miR-34c-5p抑制剂与VPA联合处理SH-SY5Y细胞,可逆转VPA对ATG4B表达的下调作用.VPA处理还下调了SH-SY5Y细胞中LC3-II的表达水平(P<0.05).结论 VPA可能通过激活miR-34c-5p/ATG4B信号通路而抑制SH-SY5Y细胞自噬.
关键词： 丙戊酸钠 SH-SY5Y细胞 Atg4B miR-34c-5p 自噬
