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类风湿关节炎滑膜组织T7噬菌体展示cDNA文库的构建
目的:构建类风湿关节炎(RA)滑膜组织T7噬菌体展示cDNA文库,为筛选和鉴定RA特异性基因的研究奠定基础.方法:取确诊RA患者的滑膜组织,用Trizol试剂提取总RNA,Oligotex离心柱分离mRNA,电泳检测其质量,逆转录合成双链cDNA,经末端修平、接头连接、酶切后去除过多接头,收集＞300 bp的cDNA片段,与T7Select 10-3载体连接,体外包装并扩增得到类风湿关节炎滑膜组织T7噬菌体展示cDNA文库.后,通过铺平板滴度测定及PCR技术鉴定文库质量.结果:所构建原始文库重组克隆数为2×107 pfu,扩增滴度8.9×1010 pfu/ml.PCR法检测片段插入率为90%,插入片段在300～2 000 bp之间.文库噬菌体裂解液PCR扩增得到BiP基因片段.结论:成功构建了高质量的RA滑膜T7噬菌体展示cDNA文库,为下一步RA自身抗原的筛选奠定了基础.
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日本血吸虫童虫文库免疫筛选及其高丰度表达膜蛋白初步鉴定
目的获得新的可能具有诊断意义的血吸虫蛋白分子并对其鉴定.方法免疫学方法筛选日本血吸虫童虫cDNA文库,对获得的阳性克隆进行测序分析,设计引物体外扩增目的蛋白基因,将其亚克隆入原核表达载体pET28a中,并转化大肠埃希菌BL21,进行诱导表达,后用Western blotting鉴定.结果获得34个阳性克隆,选择其中24个进行测序,其中13个是日本血吸虫相对分子质量(Mr)为22600膜相关蛋白(Sj22.6)基因.Sj22.6基因在体外被成功扩增,并被亚克隆入pET28a中进行表达.Western Blotting结果显示,菌体表达的条带可以被感染兔血清以及血吸虫患者血清识别.结论 Sj22.6膜相关蛋白基因在童虫cDNA文库中可以被高频率筛出,融合蛋白Sj22.6成功地在BL21中表达并具有免疫反应性.
