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双重荧光定量PCR检测志贺毒素stx1和stx2基因
目的 建立一种双重荧光定量PCR检测志贺毒素stx1和stx2基因的方法.方法 根据不同细菌来源的stx1和stx2序列,设计PCR引物和TaqMan探针,建立双重实时荧光定量PCR检测体系,进行灵敏度、特异性和重复性评价,并对腹泻患者粪便样本进行检测分析.结果 双重实时荧光定量PCR检测含志贺毒素基因重组质粒的低检测下限为102 copies/mL;该法对12种常见肠道病原菌均无特异性扩增,对不同浓度的标准质粒检测重复性高,Ct值变异系数均小于10％;对急性腹泻粪便标本的检测阳性率高于细菌分离培养.结论 建立的双重实时荧光定量PCR可作为不同细菌来源的志贺毒素基因的快速鉴定方法,亦可用于人感染性腹泻标本的快速筛查.
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双重实时荧光PCR检测肠出血型大肠埃希菌stx1和stx2基因方法的建立
目的 建立一种检测肠出血型大肠埃希菌(EHEC)产毒基因stx1和stx2的TaqMan双重实时荧光PCR法.方法 根据GenBank公布的EHEC stx1和stx2基因序列进行比对后设计相应的PCR引物和TaqMan探针,探针报告基团分别使用FAM和HEX标记,淬灭基团使用BHQ1标记.建立双重实时荧光PCR反应体系并对反应条件进行优化,对方法的灵敏度、特异性及其重复性进行分析.结果 建立了EHEC双重实时荧光PCR检测方法.菌液浓度为102～108 cuf/ml时,均可观察到扩增曲线,且扩增曲线平滑;检测30份模拟临床样品,均检测到stx1和stx2基因,且均培养出EHEC,该方法灵敏度为100％;3次重复测定108、105、102 cfu/ml 3个高、中、低浓度的菌液DNA模板,得到其扩增曲线,计算各浓度的Ct值标准差及变异系数,均小于5％,在误差允许范围内.结论 建立的双重实时荧光PCR法可快速、灵敏、特异、有效地检出EHEC.
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肠出血性大肠埃希菌双重实时荧光PCR检测方法的建立
目的 建立快速、灵敏、特异、有效的肠出血性大肠埃希菌(EHEC)双重实时荧光PCR检测方法.方法 根据GenBank公布的EHEC的stx1和stx2基因序列设计相应的PCR引物和TaqMan探针,探针分别用FAM-BHQ1和HEX-BHQ1标记stx1及stx2,建立双重实时荧光PCR反应体系,并对方法的灵敏度、特异性及其重复性进行分析.结果 建立了EHEC双重实时荧光PCR检测方法.结果显示该方法特异性、重复性好、灵敏度高,低检出限可达102 cfu/ml,117.5 fg/μl.结论 建立的双重实时荧光PCR方法可快速、灵敏、特异、有效地检出EHEC.
关键词： 肠出血性大肠埃希菌(EHEC) 实时荧光PCR STX1 stx2
