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肺炎克雷伯菌CS309耐药基因检测和NDM-1基因的克隆及原核表达
目的 检测产NDM-1肺炎克雷伯菌CS309是否同时携带产IMP、VIM型金属β-内酰胺酶或KPC型碳青霉烯酶的耐药基因,同时构建NDM-1基因原核表达质粒,并在大肠埃希菌中进行表达.方法 采用聚合酶链反应(PCR)扩增IMP、VIM和KPC耐药基因;以产NDM-1肺炎克雷伯菌CS309为DNA模板,PCR扩增NDM-1全长,并将其与pGEM-T克隆载体连接后转化至大肠埃希菌DH5α,继而对阳性克隆进行双酶切,将酶切片段与pET-28α(+)表达载体连接,并转化大肠埃希菌BL21,再用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,并采用SDS-PAGE和Western blot技术验证NDM-1蛋白.结果 经PCR和测序证实,该菌同时携带NDM-1和IMP-4两种金属酶基因,未扩增出VIM、KPC耐药基因.经双酶切和测序证实,原核表达质粒pET-28α(+)-NDM-1构建成功.SDS-PAGE发现,重组菌株经诱导后在28 kDa附近有明显条带,与预期蛋白大小27.9 kDa一致.Western blot表明诱导产生的融合蛋白可与NDM-1抗体特异性结合.结论 肺炎克雷伯菌CS309同时携带NDM-1和IMP-4两种金属酶基因;成功构建了NDM-1基因的原核表达质粒,该质粒在大肠埃希菌BL21中高效融合表达.
关键词： 新德里金属β-内酰胺酶1型 肺炎克雷伯菌 克隆 融合蛋白 -
携带blaNDM-1基因的ST22型肺炎克雷伯菌引起新生儿医院感染
目的 探讨耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌临床株的分子流行病学特征,为医院感染的控制和预防提供指导.方法 3株对碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌临床菌株分离自山东某医院新生儿病房患儿的抽吸痰液和血液标本;用Vitek 2 Compact系统进行细菌鉴定和药敏试验;改良Hodge试验检测菌株是否产碳青霉烯酶;PCR检测菌株携带的碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaBIC、blaoXA-48、blaNDM、blaIMP、blaVIM、blaSPM、bla AIM、blaGIM、blaSIM和blaDIM)、β-内酰胺酶基因(blaCrX-M、blaSHV、blaTEM和6laoXA-1)、AmpC酶基因(blaMOX、blaCIT、blaDHA、blaACC和blaEBC)、喹诺酮耐药相关基因(qnrA、qnrB、qnrS、oqxA和oqxB和磷霉素耐药基因(fosA3),测序确认其基因型;用多位点序列分型和脉冲场凝胶电泳分析细菌的同源性;质粒接合和Southern杂交试验分析质粒的特性,并进行质粒不相容群检测.结果 3株肺炎克雷伯菌Hodge试验呈阳性,且对大部分抗菌药物耐药,均携带blaNDM-1、blaTEM-1 、rosA3、oqxA和oqxB基因.脉冲场凝胶电泳显示3株菌的带型完全一致,属于同一克隆,而且多位点序列分型也都是ST22,提示存在流行.质粒接合和Southern杂交试验表明供体菌携带blaNDM-1质粒(pTA-NDM)可通过接合方式转移到受体菌,且质粒大小约220 000 bp,不相容群分型属于IncA/C型质粒.结论 同时携带blaNDM-1、6laTEM-1、rosA3、oqxA和oqxB基因的ST22型肺炎克雷伯菌在新生儿病房中的流行属国内外首次报道,应引起重视.
关键词： 肺炎克雷伯菌 新德里金属β-内酰胺酶1型 新生儿 医院感染 -
产NDM-1肺炎克雷伯菌中国分离株的初步研究
目的 探讨湖南地区出现的肺炎克雷伯菌新德里金属β-内酰胺酶1型( NDM-1)基因特征及其与耐药性的关系.方法 临床菌株分离自湖南某综合医院一例重症肺炎并中毒性心肌炎患儿的痰液标本.采用全自动微生物分析系统VITEK-2 compact对菌株进行鉴定及药敏检测；改良Hodge试验筛查碳青霉烯酶；双纸片协同试验及双纸片增效试验检测金属β-内酰胺酶；聚合酶链反应(PCR)特异性扩增NDM-1基因,并对扩增产物进行测序和BLAST分析；质粒接合转移试验分析其耐药机制,并对接合前后的药敏结果进行比较.结果 该菌株经鉴定为肺炎克雷伯菌.改良Hodge试验、双纸片协同试验及双纸片增效试验均为阳性.PCR扩增产物基因序列与GenBank中NDM-1基因FN396876.1同源性为100％.以筛选的接合子DNA为模板扩增NDM-1基因全长并测序,结果与供体菌NDM-1基因扩增产物完全一致.接合子E.coli J53( NDM-1)对所有β-内酰胺类药物的MIC值较受体菌E.coli J53均有很大提高,其中对厄他培南和亚胺培南MIC均提高了8倍以上,头孢他啶及头孢曲松则提高了64倍以上.结论 中国大陆出现了产NDM-1肺炎克雷伯菌；NDM-1基因可在不同菌株之间传递,导致细菌对β-内酰胺类药物广泛耐药.
关键词： 新德里金属β-内酰胺酶1型 肺炎克雷伯菌 基因 耐药 中国
