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凋亡素原核表达载体构建及活性测定
背景：体外合成或通过基因工程表达的凋亡素 Apoptin 是一种可以特异性地诱导肿瘤细胞凋亡，而对人体正常细胞无毒性和转化活性的蛋白，为抑制肿瘤的生长提供可能。
目的：构建凋亡素基因的原核表达载体，优化诱导蛋白表达的相关条件，检测纯化所得目的蛋白的活性。
方法：将已构建好的凋亡素基因亚克隆至原核表达载体 pET-28b(+)中，将该质粒转化至大肠杆菌E.coli宿主菌中，以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)对其进行诱导表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析目的蛋白，并检测所表达的目的蛋白对肿瘤细胞的增殖抑制作用。
结果与结论：凋亡素基因被成功的克隆至 pET-28b(+)，在26℃、IPTG 0.5 mmol/L诱导8 h的情况下，Apoptin为包涵体表达，表达产物经 SDS-PAGE 分析，在相对分子质量约15000的位置出现目的蛋白条带，大小与预期结果一致，经变复性和亲和层析纯化后，获得高纯度目的蛋白，进一步检测发现其对肺癌细胞 H460及H1299具有一定的促凋亡作用。实验成功构建了凋亡素原核表达载体PET-28b-Apoptin，获得了具有一定生物活性的目的蛋白，为进一步研究凋亡素的功能和开发其应用价值研究奠定了基础。 -
凋亡素原核表达载体的构建、表达与抗体制备
目的 构建凋亡素基因的原核表达载体,进行表达并制备表达蛋白的多克隆抗体.方法 构建凋亡素 pGEM-T/Apoptin载体,并将凋亡素基因亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,将该质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)受体菌中,以IPTG对其进行诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白.用表达蛋白常规免疫Balb/c小鼠,间接ELISA检测小鼠血清中抗体的滴度.结果 凋亡素基因被成功的克隆至pET-28a(+),表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子量约17 000的位置出现目的蛋白条带,大小与预期结果一致,Balb/c小鼠经5次免疫后,得到了滴度为1:5×10~5血清抗体.结论 凋亡素原核表达载体的成功构建和多克隆抗体的制备为进一步研究凋亡素的功能和凋亡素的应用研究奠定了基础.
