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热休克蛋白90在预热适应成纤维细胞中作用
目的建立小鼠成纤维细胞株NIHF-3T3应激适应细胞模型,探讨热休克蛋白90(HSP90)在应激适应中的作用及机制.方法通过预热适应(42℃,20min)建立应激适应细胞模型,并通过再次热应激时(44℃,40min)细胞膜损伤指标、DNA损伤指标、细胞形态学改变综合评价适应效果.以免疫细胞化学检测应激适应对细胞内HSP90合成和细胞内定位的影响.结果结合预适应后再次热应激所致的损害情况,初步确定预适应后6 h为佳应激保护时间.再次热应激时,细胞膜损伤指标、DNA损伤指标、细胞形态改变均表明预适应后预处理(42℃,20min)6 h后,再次热应激时,培养液中乳酸脱氢酶(LDH)漏出变化率、细胞DNA受损较直接热应激组为轻,细胞损伤状态减轻.热应激40 min后细胞内HSP90含量均呈现下降趋势,并伴有细胞内的重新分布.结论通过对NIH-3T3细胞进行预适应处理,通过观测细胞膜损伤、DNA损伤、细胞形态变化情况,确定应激保护的时间点,建立了细胞应激适应模型,初步确认HSP90在该模型中的保护作用.
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HSP90高表达细胞系的建立及其对底物蛋白结合能力的影响
目的建立HSP90稳定高表达细胞系,探讨HSP90在应激适应中的作用及其机制.方法含人类HSP90β全长基因的质粒pSmycHSP经酶切鉴定、大肠杆菌转化、质粒提取纯化后,以电穿孔转染,G418筛选建立HSP90稳定高表达的小鼠成纤维细胞系.通过免疫共沉淀方法,观察HSP90表达与底物蛋白HSP70、Raf-1的结合情况.结果经G418筛选的阳性克隆HSP90 clone细胞HSP90胞膜、胞核强染.免疫共沉淀结果表明,细胞内HSP90含量、HSP90结合的Raf-1量、HSP90结合的HSP70量变化趋势为外源性HSP90转染细胞＞对照.结论 HSP90高表达导致HSP90蛋白与部分底物蛋白的结合性改变.提示细胞可通过HSP90分子伴侣功能,抗衡应激反应中蛋白质变性引起的细胞损伤.
