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点带石斑鱼过敏原分离、鉴定与纯化
目的 对点带石斑鱼的主要过敏原进行分离、鉴定与纯化.方法 通过十二烷基硫酸钠-聚丙炳酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离点带石斑鱼的蛋白质组份,采用免疫印迹(western-blotting)方法鉴定过敏原,通过离子交换层析对主要过敏原进行初步纯化.结果 SDS-PAGE结果显示,点带石斑鱼粗提液含有13条蛋白带,含量高的有8条,分子量分别为43,34,28,25,22,17,15,9 kD;westem-blotting显示,对点带石斑鱼过敏患者的阳性混合血清能与其中4个蛋白条带起反应,分子量分别为34,28,24,22 kD.离子交换层析可初步纯化出22 kD的过敏原蛋白.结论初步分离得到分子量为22 kD的点带石斑鱼主要过敏原,为临床诊断和治疗鱼类过敏性疾病提供理论依据.
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点带石斑鱼抗菌肽hepcidin基因克隆及其成熟肽的原核融合表达
目的 克隆点带石斑鱼hepcidin前体cDNA序列,构建其成熟肽pET-32a融合表达载体.方法 根据已报道的硬骨鱼类hepcidin eDNA序列设计简并引物,以点带石斑鱼(Epinephelelus malabaricus)肝脏为材料,通过RT-PCR扩增hepcidin cDNA序列.用比对推导的氨基酸序列预测其成熟肽段.再将成熟肽cDNA序列亚克隆至pET-32a构建原核表达并进行原核融合表达.结果 获得点带石斑鱼hepeidin-like抗菌肽前体cDNA序列1条,GenBank登录号为HM474788.DNA序列的Blast分析以及推导氨基酸序列NJ进化树分析表明,HM474788是点带石斑鱼第1条报道的抗菌肽hepcidin cDNA序列.成功构建了该序列的成熟肽原核融合表达载体pET-32a-hepcidin(EMl),并成功在大肠杆菌origami(DE3)中表达.结论 成功克隆点带石斑鱼hepcidin-1ike抗菌肽前体eDNA序列,成熟肽成功在大肠杆菌中融合表达,为后续有关石斑鱼hepcidin的功能研究与实践应用奠定重要基础.
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点带石斑鱼神经坏死病毒基因组分析
[目的]准确诊断发生在福建南部点带石斑鱼育苗场的鱼病.[方法]根据基因库中已报告的石斑鱼NNV核苷酸序列,设计了8对特异性引物,用于扩增点带石斑鱼NNV的RNA1和RNA2特定片段.PCR扩增产物经琼脂糖电泳确认后进行核酸测序,用相应软件进行拼接,得到点带石斑鱼NNV基因组全序列.用DNAstar软件对该序列进行分析,得到相应的氨基酸序列.[结果]该病毒的RNA1含有一个编码依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependant RNA polymerase,RdRp)的开放阅读框(ORF)为2949nt,编码1个由982个氨基酸组成的蛋白质;RNA2的ORF为1017nt,编码1个由338个氨基酸组成的病毒主衣壳蛋白.将这些核苷酸序列以及推导的氨基酸序列与基因库中同属于罗达病毒科(Nodaviridae)的其他罗达病毒进行同源性比较,该病毒与其他已知的石斑鱼NNV的同源性高.系统发育进化分析也表明,点带石斑鱼NNV与其他石斑鱼NNV亲缘关系很近,同属于赤点石斑NNV血清群,与其他β罗达病毒有一定的距离,与α罗达病毒则有明显的不同.[结论]福建南部个别点带石斑鱼育苗场的石斑鱼感染了神经坏死病毒.
