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Duchenne肌营养不良一家系基因诊断与产前诊断
目的 对Duchenne肌营养不良(DMD)先证者进行基因诊断,胎儿进行产前诊断. 方法 分别使用多重连接探针依赖扩增(MLPA)方法及多重聚合酶链式反应(PCR)法,对Dystropin基因外显子52缺失导致的DMD患者进行基因诊断,同时用相同方法对患儿母亲及对羊水细胞进行产前诊断. 结果 MLPA方法显示,先证者Dystropin基因外显子52缺失,其母亲不携带有缺失突变;羊水检测显示为男性胎儿,与先证者具有相同的X-STR单倍型,但不携带DMD缺陷基因.结论 MLPA方法可以有效检测基因缺失或重复导致的DMD患者,对单个Dystropin基因外显子缺失导致的患者,需要应用PCR方法或基因测序方法进行验证.
关键词： Duchenne肌营养不良 Dystropin基因 产前诊断 -
应用10对引物多重PCR方法检测DMD基因缺失
目的 建立适合于Duchenne型进行性肌营养不良(DMD)临床基因诊断的10对引物多重PCR方法,并探讨其临床应用价值.方法 抽提55例DMD患者及正常对照者外周血DNA,选取肌营养不良蛋白基因的10对外显子引物,应用多重PCR反应方法,同时扩增10个特异性片段,扩增产物行聚丙烯酰胺凝胶电泳.结果 55例DMD患者中,28例(50.9%)存在外显子缺失.27例(49.1%)未检测到缺失;25例缺失片段集中于第45～53外显子,3例缺失片段集中于第12-19外显子.第50外显子缺失频率高;其次为外显子45、47、51、52,再次之为外显子12、53.结论 DMD基因缺失片段主要分布于第45-53、12-19外显子2个缺失热点区域.该方法具有临床应用价值,是检测DMD基因缺失的首选方法.
关键词： Duchenne肌营养不良 基因缺失 多重PCR 基因诊断 -
Mdx小鼠骨骼肌中炎症反应和mpeg1的表达
目的 探讨mdx小鼠不同时期骨骼肌的炎性病理改变,观察mpeg1在mdx小鼠及对照鼠中的表达.方法 选取雄性C57 BL/10ScSn-Dmdmdx/JNju鼠为实验组,对照组为雄性C57 BL/6ScSn小鼠,根据年龄分为2w、4w、8 w、12w4个亚组.通过HE染色、MGT染色、ACP染色观察骨骼肌光镜下的形态学改变,总结mdx小鼠骨骼肌炎性病理变化.通过RNA提取,基因芯片的检测及mpegl的qRT-PCR检测,观察mpeg1的表达情况.结果 常规组织染色中,2w的mdx小鼠肌肉偶见高度浓染的肌纤维,未见肌细胞坏死,炎症细胞浸润,4w可见巨噬细胞吞噬现象散在分布,8 w时炎细胞浸润灶融合成片,12w时炎性病灶面积减小;利用基因芯片技术筛选出mdx小鼠中有关炎症反应的基因30余个,结果显示与2 w相比,炎症反应相关基因表达量均增加,在8 w时达到峰值,12 w有所下降,但较2 w时仍有升高;qRT-PCR结果显示从4w开始,mdx小鼠中mpeg1的含量逐渐增加,8 w时含量高.结论 (1)炎症反应参与mdx小鼠疾病的发生发展:从2w开始出现,8 w达到高峰,12 w趋于平稳;(2)Mpeg1在mdx小鼠炎症反应中发挥了一定的作用.
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DMD的基因治疗研究进展
Duchenne肌营养不良(DMD)为X连锁隐性遗传性肌病,目前临床无有效治疗手段,基因治疗具前景.近几年里,基因治疗的研究取得了较大的进展,尤其表现在出现了一些新的基因治疗手段,同时病毒载体的改进也使治疗基因的表达效率有了明显提高,这些进展必将有助于基因治疗的临床实验早日开展.
关键词： Duchenne肌营养不良 基因治疗 病毒载体 -
重组腺相关病毒介导的Dystrophin小基因载体构建及在mdx鼠中表达
目的:研究重组腺相关病毒载体(rAAV)介导的人Dystrophin小基因(SMCKA3999)载体构建及在DMD模型鼠(mdx鼠)的表达.方法:将SMCKA3999质粒,包装质粒pXX2、腺病毒成分辅助质粒pXX6共转染293细胞,包装重组腺相关病毒载体介导的SMCKA3999基因(rAAVSMCKA3999),以斑点杂交法测定病毒滴度,将rAAVSMCKA3999单点注射到mdx鼠腓肠肌,于注射后7个月取肌肉提取蛋白质行Western blot检测.结果:经三质粒共转染法构建的rAAVSMCKA3999病毒滴度为5.0×1010,在mdx鼠骨骼肌表达持续7个月以上.结论:构建的rAAVSMCKA3999载体为进一步DMD基因治疗研究奠定了基础.
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重组腺相关病毒(rAAV)介导基因SMCKA3999对Duchenne肌营养不良病理和功能的影响
目的研究重组腺相关病毒(rAAV)载体介导的dystrophin小基因SMCKA3999治疗DMD模型鼠mdx,从病理和功能观察rAAVSMCKA3999治疗对DMD模型小鼠mdx的疗效.方法以dystrophin小基因SMCKA3999为目的基因,将SMCKA3999克隆至rAAV并包装成rAAVSMCKA3999,以5×1010病毒颗粒单点注射于DMD模型鼠mdx腓肠肌,基因治疗后4个月及7个月,采用免疫荧光、光镜组织病理、肌电图等方法,从形态和功能观察rAAVSMCKA3999治疗对DMD模型小鼠mdx的疗效.结果rAAVSMCKA3999使肌膜缺失的dystrophin恢复并稳定表达持续7个月以上,肌肉组织病理改变好转,肌病肌电图改变明显改善,疗效持续4个月以上.结论rAAVSMCKA3999能改善mdx小鼠骨骼肌的病理及功能,采用rAAV介导的dystrophin小基因SMCKA3999对Duchenne肌营养不良基因治疗是有希望的治疗方法.
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有Duchenne肌营养不良家族史孕妇的产前基因诊断
目的 对有Duchenne肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)家族史的孕妇进行产前诊断研究.方法 PCR检测胎儿的性别决定基因(SRY)和DMD基因常见缺失的18个外显子,同时用DMD基因的6个(CA)n重复序列STR位点进行连锁分析,对31例有DMD家族史的孕妇进行产前诊断;随访健康胎儿出生后的发育情况,评估产前诊断方法 的可靠性.结果 32例胎儿(1例双胎)中,18例女性胎儿中有6例为DMD基因携带者;14例男性胎儿中4例为DMD患儿.结果 对DMD高风险胎儿进行SRY基因检测,联合应用DMD基因的18个外显子检测和连锁分析能够准确、有效地产前诊断DMD.
关键词： Duchenne肌营养不良 基因 产前诊断 -
Duchenne肌营养不良基因缺陷及基因治疗
Duchenne肌营养不良(DMD)是常见的神经肌肉遗传病之一,由于骨胳肌肌膜上的抗肌萎缩蛋白(dystrophin)完全或部分缺失引起.本文介绍了dystrophin的结构和功能,对DMD基因治疗的目的基因,基因治疗方式(包括病毒载体和非病毒载体),基因转染途径作了较为全面的介绍,指出腺相关病毒载体介导的基因治疗及干细胞移植是有希望的治疗方向,经全身途径使目的基因广泛转染骨胳肌并实现心肌和膈肌的转染,是基因治疗研究的难点.
关键词： Duchenne肌营养不良 抗肌萎缩蛋白 基因治疗 -
Duchenne肌营养不良心肌病1例
Duchenne肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy, DMD)是隐性X染色体连锁遗传病是主要影响骨骼肌和心肌的神经肌肉疾病,在人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man, OMIM)代号为310200,基因图谱定位于Xp21.2,发病率约30/10万.DMD心肌病是由于缺乏抗肌营养不良蛋白,导致一种从左室开始受累的特殊心肌病(好发于左室后基底部和侧壁).虽然抗肌营养不良蛋白基因突变和心脏病变之间的关系仍不明确,但大部分DMD心肌病患者死亡是由左室纤维化、心律失常和心功能衰竭造成的.我们报告1例合并严重心功能不全和高血浆肌酸激酶(Creatine Kinase, CK)的DMD心肌病,此例患者没有DMD的家族遗传背景,可能是散发遗传伴随心脏严重受累.
关键词： Duchenne肌营养不良 心肌病 -
Duchenne肌营养不良模型鼠基因型及肌肉病理的研究
目的 研究Duchenne肌营养不良(DMD)模型鼠mdx基因型及肌肉病理改变.方法 分别采用光镜、免疫荧光、Evans Blue染料、电镜等方法研究mdx小鼠与正常对照组C57/BL6小鼠腓肠肌病理改变,并检测mdx小鼠的基因型.结果 经Dys-3、δ-sarcoglican抗体染色后mdx小鼠肌膜基本未见绿色荧光,正常对照组C57/BL6小鼠肌膜呈明显网状绿色荧光;荧光显微镜观察EvansBlue红色荧光染料,mdx小鼠肌纤维呈明显红色荧光,而肌膜完整的正常对照组C57/BL6小鼠肌纤维不摄取红色荧光染料.mdx模型鼠肌丝排列紊乱,方向不一,肌细胞核位于肌纤维中央,Z盘模糊,肌膜局部不连续,C57/BL6o小鼠肌丝排列整齐,Z盘清晰可见.结论 mdx小鼠以肌纤维变性、坏死为特征,肌细胞膜缺损是mdx小鼠主要病理改变之一.mdx小鼠dystrophin基因缺陷同时伴有dystrophin相关蛋白缺失,mdx小鼠肌肉病理为DMD进一步治疗研究奠定了基础.
关键词： Duchenne肌营养不良 Mdx 免疫荧光 超微病理 -
重组腺相关病毒载体介导的小基因SMCKA3999治疗对Duchenne肌营养不良肌力的影响
目的研究重组腺相关病毒载体(rAAV)介导的人dystrophin小基因SMCKA3999对DMD病理、肌力改变的治疗作用.方法将dystrophin小基因SMCKA3999克隆至rAAV并包装成rAAVSMCKA3999病毒,以5×109病毒颗粒多点注射于DMD模型鼠mdx腓肠肌,基因治疗4月后免疫荧光法检测肌膜dystrophin基因表达,治疗5月后采用肌肉离体灌注电刺激测定腓肠肌肌力,观察rAAVSMCKA3999对mdx鼠肌力的疗效.结果rAAVSMCKA3999有效稳定表达并使肌膜缺失的dystrophin恢复,明显改善mdx鼠肌力.结论rAAVSMCKA3999对DMD治疗有效,能显著改善mdx鼠肌肉功能,应用重组腺相关病毒载体介导的dystrophin小基因SMCKA3999是治疗DMD有希望的方法.
关键词： Duchenne肌营养不良 重组腺相关病毒载体 基因治疗 肌力 -
应用分子标记对Duchenne型肌营养不良胎儿的产前基因诊断
目的:对未知遗传类型的Duchenne肌营养不良(DMD)家系早期妊娠风险胎儿进行产前基因诊断,确定能否接续妊娠,并探讨检测技术.方法:通过TRIzol方法从孕妇羊水中提取胎儿DNA,用Promega提血试剂盒提取家系其他成员外周血中的DNA.选取Xp21.1区附近的6对荧光引物对12个样本DNA进行PCR扩增和多态性连锁分析,以确定风险X染色体;通过DMD50和SRY 2对引物的多重PCR扩增确定胎儿性别.连锁分析与性别鉴定相结合对胎儿进行产前诊断.结果:发现该胎儿为1正常女胎,未携带风险X染色体,且胎儿产后复查结果与产前检测一致.结论:这种方法提示对缺失或/和非缺失型DMD风险胎儿的检测可一步完成,而且扩大了基因的检测范围,诊断结果更为准确可靠.
关键词： Duchenne肌营养不良 连锁分析 产前基因诊断 -
Duchenne肌营养不良患儿的智力特点及与基因突变关系初步探讨
目的 了解国内Duchenne肌营养不良(DMD)患儿智力水平及智力低下的比例,初步探讨DMD患儿智力的结构特点及与基因突变类型的关系.方法 选择2009年1月至2011年3月的102例DMD患儿,其中84例患儿通过多重连接依赖式探针扩增(MLPA)方法进行DMD基因检测.102例DMD患儿中,选择≥6岁的50例DMD患儿作为DMD组;另选取50例年龄、性别与DMD组匹配的健康体检儿童作为对照组.采用韦氏智力量表对两组儿童进行智力及智力结构分析.结果 102例DMD患儿的平均智商为84±21,其中30例(29.4%)总智商低于70.DMD组患儿总智商、言语智商、操作智商及其11项分测验得分均显著低于对照组(P<0.01).其中DMD基因56-79号外显子突变患儿的智商低(59.3±11.9),另外,45-55号外显子突变患儿的智商(88.6±1.9)明显低于1-29号(97.5±9.6)和30-44号(102.8±3.8)外显子突变的患儿(P<0.01).结论 DMD患儿的总智商、言语智商、操作智商均显著低于正常儿童.DMD患儿智力低下与基因突变存在联系.
关键词： Duchenne肌营养不良 智力 基因突变 儿童 -
慢病毒载体介导的截短肌营养不良蛋白cDNA的表达
目的 探讨慢病毒载体介导的截短肌营养不良蛋白cDNA表达的可行性.方法 将PCR克隆所构建的三个截短的肌营养不良蛋白cDNA插入到慢病毒载体,再将此载体转染至293Ad5+细胞中包装为重组病毒.用重组病毒感染培养的鼠成肌细胞,通过蛋白免疫印迹检测鼠成肌细胞中截短肌营养不良蛋白cDNA的表达. 结果 用PCR克隆所构建的三个截短肌营养不良蛋白cDNA通过慢病毒载体导入鼠成肌细胞后均可表达出特异产物.结论 慢病毒载体可介导截短肌营养不良蛋白cDNA的表达,截短肌营养不良蛋白cDNA和慢病毒载体分别有望作为基因治疗Duchenne肌营养不良的目的基因和载体.
关键词： Duchenne肌营养不良 肌营养不良蛋白 慢病毒 成肌细胞 -
肌肉特异性microRNAs在Duchenne肌营养不良全血中的表达
目的:分析肌肉特异性microRNAs(miRNAs/miRs)(miR-206、-1、-133a/b)在Duchenne肌营养不良(DMD)患儿全血中的表达,探讨其作为诊断DMD的新型生物标志物的可能性. 方法:采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测DMD组与健康对照组全血中肌肉特异性miRNAs的表达,采用Pearson相关分析法验证DMD组肌肉特异性miRNAs与年龄、肌力与肌肉功能之间的相关性,绘制ROC曲线判断肌肉特异性miRNAs作为DMD诊断标准的可靠性.结果:DMD组肌肉特异性miRNAs在全血中的表达明显高于对照组(P < 0.05),且与年龄呈低度负相关(P < 0.05),与肌力、肌肉功能呈中度正相关(P < 0.05);ROC曲线显示肌肉特异性miRNAs的ROC曲线下面积(AUC)≥0.87,灵敏度及特异度均良好.结论:肌肉特异性miRNAs (miR-206、-1、-133a/b)在全血中的表达水平可以反映DMD的临床病情进展情况,有望成为诊断DMD的新型生物标志物.
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MRI对Duchenne肌营养不良的诊断价值
目的 探讨MRI对Duchenne肌营养不良的诊断价值.方法 收集确诊为Duchenne肌营养不良的男性患儿64例,行盆底(62例)、大腿(62例)、小腿(59例)(共692组肌群)MRI检查,轴位T1WI、T2 WI、SPIR及冠位T2 WI扫描.由2名高年资医生独立重点观察:(1)肢体肥大或萎缩;(2)病变肌肉对称性;(3)病变肌肉累及分布;(4)MRI信号特点(脂肪浸润或炎性水肿);(5)9例治疗后复查改变.结果 (1)肢体肥大者17例(26.56％),萎缩者12例(18.75％).(2)4例(6.25％)两侧肌群累及不对称,余肌群受累基本对称.(3)①盆肌:臀大肌受累87.10％,盆底收肌67.74％(x2=6.643,P=0.010).②大腿:股四头肌82.26％,股二头肌75.81％,半腱肌62.90％,半膜肌80.65％,缝匠肌69.23％,股薄肌22.58％(x2=67.075,P=0.000).③小腿:胫骨前肌23.73％,胫骨后肌32.20％,腓肠肌81.36％,比目鱼肌57.63％(x2=48.218,P=0.000).上述肌群均表现有脂肪浸润共352组(352/692,50.87％).其中,发现炎性水肿者203组(203/352,57.67％).≥50％伴有炎性水肿肌群见于臀大肌、股四头肌、胫骨前肌、胫骨后肌和比目鱼肌.(4)9例患者经2～5年治疗复查,MRI变化不一致.结论 MRI对Duchenne肌营养不良的检查诊断有重要作用.下肢肌肉改变应重点观察大肌群如臀大肌、股四头肌、半膜肌及腓肠肌等.
关键词： Duchenne肌营养不良 磁共振成像 -
Duchenne肌营养不良的治疗研究现状
Duchenne(杜氏)肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)又称假性肥大型进行性肌营养不良,是一类常见的X连锁隐性遗传性肌肉疾病,其主要的临床特征为进行性肌无力,丧失运动功能是该病的核心表现.该病的致病原因为抗肌萎缩蛋白基因的突变.绝大多数为男性患儿,通常在儿童期发病.随着分子生物学诊断治疗技术近几年的发展,杜氏肌营养不良的治疗也有新的突破.本文从传统疗法、基因疗法、细胞移植疗法等方面总结其治疗进展,同时研究中存在的一些问题亟待解决.
关键词： Duchenne肌营养不良 治疗 研究进展
