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新疆中麻黄基因组DNA文库的构建
目的:构建新疆中麻黄(Ephedra Intermedia)的基因组DNA文库.方法用Sau3AI对所提新疆中麻黄基因组DNA进行酶切,回收15-23Kb之间的酶切产物片段,然后与Lambda vector BamH I Arms进行连接、包装形成文库,计算文库重组噬菌体滴度、包装效率.结果,所建文库的重组噬菌体滴度为1×106pfu/ml、包装效率为2×106重组子/μg载体DNA.结论成功构建了基因组DNA文库,为进一步研究奠定了基础.
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新疆甘草DNA片段的克隆、序列分析及其基因组DNA文库的构建
目的克隆新疆甘草DNA片段,构建新疆甘草基因组DNA文库.方法对新疆产4种甘草进行随机扩增多态性DNA(RAPD)分析,回收甘草随机引物s121的PCR产物中500bp左右的带,克隆到pMD18-T载体中,经电泳鉴定后测定序列,进行序列分析.用Sau3AI对所提新疆甘草基因组DNA进行酶切,回收15～23kb之间的酶切产物片段,然后与Lambda vector BamH I Arms进行连接、包装形成文库,计算文库重组噬菌体滴度、包装效率.结果获得了甘草490bp的DNA片段,所建文库的重组噬菌体滴度为3×106pfu/ml、包装效率为6×106重组子/μg载体DNA.结论成功克隆了新疆甘草DNA片段,并构建了基因组DNA文库,为进一步研究奠定了基础.
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通过石蜡包埋组织标本构建肝细胞癌基因组文库的研究
目的 探讨通过石蜡包埋组织标本构建肝细胞癌( hepatocellular carcinoma,HCC)肿瘤组织基因组DNA文库的方法.方法 收集符合要求的石蜡包埋HCC肿瘤组织标本,运用组织裂解改良法提取基因组DNA,构建HCC肿瘤组织基因组DNA文库,通过SmartSpecTM核酸蛋白测量法、TaqMan- MGB- PCR及琼脂糖凝胶电泳法等分析评估所得文库质量.结果 本研究共收集到2 108例合格石蜡包埋HCC肿瘤组织标本,构建了HCC组织标本基因组DNA文库,经质量监控分析所得DNA的浓度大于或接近0.1μg/μl,对应A260 /A280比值介于1.6～2.0,TaqMan- MGB- PCR实时定量曲线光滑、波峰单一,琼脂糖凝胶电泳条带单一、清晰、无拖尾现象,所构建的文库DNA质量较好,与对照DNA质量相比差异无显著性(P＞0.05).结论 通过石蜡包埋组织标本可构建用于HCC研究的肿瘤组织基因组DNA文库.
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耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a相互作用蛋白的筛选
目的 通过建立细菌双杂交技术,筛选MRSA中与PBP2a相互作用的蛋白.方法 利用PCR扩增,获得PBP2a蛋白转肽酶活性区(TPase)的编码基因,插入pRBR构建成诱饵质粒pBR-PBP2a.提取MRSA N315株基因组DNA,经Sau3AⅠ部分酶切后连接到pRAC质粒的BamHⅠ位点,获得基因组DNA表达文库;将文库质粒转化入含诱饵质粒pBR-PBP2a的报告菌株KS1,利用细菌双杂交技术进行筛选,获得与诱饵质粒编码的融合蛋白相互作用的猎物,对猎物中编码序列进行DNA测序和生物信息学分析,确定与PBP2a发生相互作用的蛋白质或多肽.结果 成功构建了pBR-PBP2a诱饵质粒,可表达PBP2a TPase与大肠埃希菌RNA聚合酶α亚单位N端序列的融合蛋白.所构建的MRSA N315株基因组文库覆盖率达9倍,满足文库筛选的需要.将文库转化含诱饵质粒和报告基因的KS1宿主菌,利用细菌双杂交技术经3次筛选,共获得9个猎物克隆,其报告基因的活性均升高2倍以上,对9个猎物质粒进行了测序,信息学分析表明它们均来自于MRSA N315株基因组,插入片段长者648 bp,短者334 bp, 9个插入片段中含14个编码基因,其中10个功能未知,1个编码二氢吡啶二羧酸合酶、1个编码二氢吡啶二羧酸还原酶,2个编码染色体解离稳定(SMC)蛋白.9个克隆中介导与PBP2a相互作用的多肽由14～46个氨基酸组成.结论 利用细菌双杂交技术从MRSA基因组文库中成功筛选到与PBP2a相互作用的多肽.
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新疆管花肉苁蓉DNA片段的克隆、序列分析及其基因组DNA文库的构建
根据新疆肉苁蓉的RAPD分析结果,结合新疆肉苁蓉的有效成份及药用价值,筛选出新疆肉苁蓉的优良种质--管花肉苁蓉,对新疆管花肉苁蓉517bp的DNA片段进行了克隆、序列测定与分析,构建了新疆管花肉苁蓉的基因组DNA文库.
