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木桶新论与护理团队建设
木桶理论即木桶定律,其核心内容是:一只沿口不齐的木桶其储水量不是由长的木板决定,而是由短的那块木板决定.一只木桶正常情况下(指木桶大小一定,也不斜放)的容水量取决于3个方面的因素:(1)每一块木板的长短,关键是短的那块木板.(2)木板和木板之间的缝隙是否紧密.(3)桶底的好坏[1].这就是木桶理论.
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CASK基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定
目的:构建人钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(CASK)基因过表达慢病毒载体并进行鉴定.方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增CASK基因片段,通过连接酶将CASK基因片段连接至线性化的GV358载体上,运用PCR方法鉴定阳性克隆的CASK GV358载体;将重组质粒和包装质粒共转染至293T细胞,并用酶联免疫吸附试验(ELISA)法进行滴度检测.将成功包装的CASK过表达慢病毒LV-CASK(OE组)和阴性对照病毒CON238(NC组)分别感染人非小细胞肺癌(NSCLC)H1299细胞,同时设空白对照组(MOCK组),用荧光定量PCR(FQ-PCR)和western blotting法检测CASK表达水平.结果:通过PCR技术成功地扩增CASK基因片段并连接到GV358病毒载体上,PCR及DNA测序鉴定结果证明CASK-GV358质粒构建正确;重组慢病毒转染293T细胞后可观察到绿色荧光及蛋白表达,包装过表达慢病毒并测定其浓缩滴度为2×108TU/mL.FQ-PCR和western blotting检测结果显示,与NC组相比,OE组CASK mRNA和蛋白的表达均显著上调(P＜0.05).结论:成功构建CASK基因过表达慢病毒载体,可在H1299细胞中稳定表达,为CASK基因的后期研究提供了实验基础.
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Id1强制表达对血管内皮细胞株ECV-304增殖能力的影响
[目的]为深入研究hCASK功能,构建Id1真核表达载体并转染ECV-304细胞,筛选出Id1强制表达细胞株,观察Id1上调表达对ECV-304细胞增殖能力的影响. [方法]采用RT-PCR方法获取编码Id1的cDNA序列,并将其导入真核表达载体成功构建pIRES2-EGFP-ld1重组表达质粒.将重组质粒转染人ECV-304细胞株,经G418加压筛选,成功筛选出Id1强制表达的细胞株.用蛋白免疫印迹法鉴定转染细胞中Id1基因的表达水平.采用流式细胞技术、细胞计数的方法观察筛选出的细胞株增殖能力的变化. [结果]成功建立了Id1强制表达的ECV-304细胞株.同未转染细胞相比,Id1强制表达细胞株中G0/G1细胞比率下降约4.8%,G2M期细胞比率上升约26.3%,增殖指数明显增高,细胞增殖能力增强. [结论]Id1强制表达细胞株的成功建立和鉴定为CASK、Id1基因功能研究提供了有效手 段.Id1的上调表达可导致ECV-304细胞增殖能力增强.
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系统性红斑狼疮中内皮细胞相关自身抗原的鉴定
目的 在内皮细胞中筛选与系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)疾病相关的自身抗原.方法 用免疫沉淀法以SLE病人血清中自身抗体捕获人脐带内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)相关抗原,并用双向电泳法分离免疫沉淀产物,然后用LC-MS-MS串联质谱鉴定与SLE病人血清反应的蛋白点.后用Western blot法验证部分鉴定蛋白.结果 相对于正常人血清对照,SLE病人血清捕获了多个内皮细胞相关蛋白,质谱鉴定结果 显示:通过免疫沉淀与双向电泳结合的方法 成功鉴定了包括GAPDH等已知SLE自身抗原在内的一系列蛋白,其中钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸蛋白激酶(calcium/calmodulin-dependent serine protein kinase,CASK)为新发现SLE候选自身抗原.并以重组人CASK蛋白证实SLE病人血清中CASK抗体水平显著高于正常人对照.结论 内皮细胞蛋白CASK可能作为一个新的SLE相关自身抗原.
