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miR-505水平与胶质母细胞瘤恶性程度相关性研究
目的 本研究旨在通过RT-qPCR 检测不同程度GBM 患者组织以及不同细胞系中miR-505的表达水平,找出二者时间的相关性.方法 通过RT-qPCR 实验检测不同程度GBM 患者组织和正常脑组织中miR-505的表达水平,以及替莫唑胺(TMZ)处理对miR-505 表达水平的影响.通过Kaplan-Meier 生存曲线分析miR-505 表达水平不同的GBM患者的生存率.结果 与非癌性脑组织相比,在GBM 组织中miR-505 表达水平较低;且高程度GBM 组织中的miR-505水平低于低程度GBM 组织;与miR-505 高水平的GBM 组织相比,miR-505 低表达与生存率降低相关;GBM 细胞中 miR-505的水平低于正常人星形胶质细胞;在细胞中用100 μmol/L的TMZ 处理24 h 后,miR-505的水平明显上调,特别是在U251 和A172 细胞中.结论 miR-505 在胶质母细胞瘤中作为肿瘤抑制剂抑制肿瘤发生,TMZ 可以提高miR- 505的表达水平.
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特异性逆转录microRNA-505的高效茎环引物的设计
目的:构建一个高效且特异性的逆转录茎环引物,以准确定量检测小鼠的miRNA-505基因,同时探讨茎环引物的结构对逆转录效率的影响.方法:规律性地改变通用茎环引物的茎部和环部的碱基结构,再进行不同的组合,利用逆转录-聚合酶链式反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)技术,探寻效率高的茎环引物.结果:当固定茎部结构为14对碱基,规律性改变环部碱基个数(15,18,21),经RT-PCR检测的CT值无差异,均为28.5;当固定环部结构为21个碱基,CT值随茎部碱基对(8,11,14)规律性地延长而逐渐增大;当环部结构为21个碱基,茎部结构为8对碱基时CT值小,为26.7.结论:环部结构对茎环引物的效率无贡献;当环部结构为21个碱基,茎部结构为8对碱基时,茎环引物的效率和特异性是佳的,适用于准确检测小家鼠的miRNA-505基因.
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利用CRISPR系统介导人类mir-505基因位点的编辑
目的:通过针对人源mir-505基因,设计不同sgRNA,从而利用CRIPSR系统对mir-505基因位点进行编辑,并探讨CRISPR系统对靶点的剪切效率的影响因素.方法:针对人源mir-505基因设计两条具有不同GC％的sgRNA,随后分别将其构建入41824-sgRNA表达载体和42230-Cas9蛋白/sgRNA共表达载体,并将表达载体利用脂质体转染法转染入人类细胞,通过T7E1assay检测不同CRISPR系统对靶点剪切效率的影响.结果:对靶点的剪切与Cas9蛋白和sgRNA的剂量成正比;当sgRNA与Cas9蛋白共传递时,也能够明显提高靶点的剪切效率;而较低的sgRNA的GC％会降低其对靶点的剪切效率.结论:本研究利用CRISPR系统靶向人源细胞的mir-505基因,使得mir-505基因发生突变.CRISPR系统对靶点的剪切效率和sgRNA和Cas9蛋白的剂量、sgRNA是否和Cas9蛋白共传递以及sgRNA的GC％有关.
关键词： CRISPR系统 miR-505 sgRNA T7E1 assay 剪切效率 -
miR-505、miR-505*在非小细胞肺癌患者组织及血清中的表达及意义
目的:初步探讨非小细胞肺癌(NSCLC)患者肺癌组织及血清中miR-505、miR-505*表达的变化及其意义.方法:收集NSCLC患者肺癌组织及血清样本,以实时定量PCR(RT-qPCR)方法检测miR-505、miR-505*表达水平;统计分析采用SPSS 19.0软件.结果:11例NSCLC组织中,miR-505、miR-505*阳性率分别为63.6％和36.4％,无显著性差异(P＞0.05).69例NSCLC(腺癌41例,鳞癌28例)血清中,miR-505的总阳性率为34.8％,其中41例腺癌患者中阳性率为36.6％,28例鳞癌患者中阳性率为32.1％,无显著性差异(P＞0.05);miR-505*的总阳性率为39.1％,其中41例腺癌患者中阳性率为32.3％,28例鳞癌患者中阳性率为60.7％,差异显著(P =0.002,P＜0.05).miR-505和miR-505*的阳性率在41例肺腺癌患者中无显著性差异(P＞0.05),而在28例鳞癌患者中差异显著(P =0.032,P＜0.05).此外,miR-505及miR-505*在放疗与否的NSCLC患者血清中的相对表达无显著性差异(P＞0.05).结论:NSCLC患者血清中miR-505、miR-505*的表达水平可能与病理类型相关.
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A549细胞经2、4 Gy X线照射后miR-505表达变化的实验研究
目的:初步探讨2、4 Gy X射线照射后人肺腺癌A549细胞miR-505体内、外表达的变化及意义.方法:2、4 Gy X射线分别照射体外培养的A549细胞,以实时定量PCR(RT-qPCR)法检测A549细胞中miR-505表达水平.分别将0、2与4 Gy X射线照射后的A549细胞经尾静脉注射裸鼠制备裸鼠肺转移动物模型,检测裸鼠肺组织及血清中miR-505的表达水平.统计分析采用SPSS 19.0软件.结果:2 Gy X射线照射A549细胞后1、2、12、及24 h,miR-505表达均显著升高(升高倍数分别为:3.09、1.82、2.19及1.24倍,P<0.01);4 Gy X射线照射A549细胞后1、2、12 h,miR-505表达亦均显著升高(升高倍数分别为:2.99、2.06、1.86倍,P<0.01).0、2、4 Gy X线照射组裸鼠肺组织中均可检测到miR-505表达显著升高(升高倍数分别为:9.28、16.55及6.84倍,P<0.05);miR-505在血清中表达水平0 Gy和2 Gy组分别为5.33和3.78,与对照组相比显著升高(P<0.05).结论:2、4 Gy X射线照射可增加A549细胞miR-505的体内、外表达水平,可能与增强A549细胞体内、外侵袭转移能力相关.
