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抑制EphA4受体活性对少突胶质前体细胞发育影响的研究
目的 探讨抑制EphA4受体活性对少突胶质前体细胞(OPC)发育的影响.方法 将分离纯化的OPC随机分为正常组、EphA4受体抑制剂处理组(EphA4-FC组).EphA4-FC组加入250 nmol/L EphA4-FC,培养至第2天.免疫细胞化学染色法观察正常组OPC特异性标志物NG2与EphA4受体的共表达情况;通过细胞计数观察两组OPC数量变化情况;通过Western blot检测两组细胞蛋白样品中OPC特异性蛋白血小板源性生长因子α受体(PDGFαR)的表达变化情况.结果 免疫细胞化学染色显示,正常体外培养OPC高表达EphA4受体;与正常组比较,EphA4-FC组的NG2+阳性细胞数量明显增多(P＜0.05).Western blot显示,与正常组比较,EphA4-FC组细胞蛋白中PDGFαR的表达显著增高(P＜0.05).结论 培养的OPC上高表达EphA4受体,通过抑制EphA4受体可以促进OPC的增殖.
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EphA4受体在大鼠前脑缺血/再灌注后海马CA1区神经元迟发性死亡中的作用观察
目的 观察大鼠海马脑区缺血/再灌注后ephrinA3激活EphA4受体对海马CA1区神经元凋亡的影响.方法 采用经典的四血管夹闭大脑缺血/再灌注模型,分别脑室内给予EphA4受体激动剂ephrinA3-Fc 以及EphA4受体阻断剂EphA4-Fc,通过TUNEL染色观察在缺血/再灌注后6、24、48h各组海马神经元凋亡情况,同时检测Caspase 3的活性,以观察EphA4/ephrinA3系统活化与CA1区神经元凋亡的关系.结果 侧脑室内给予激动剂ephrinA3-Fc后,Caspase 3的活性较单纯缺血/再灌注组有明显升高(2.76±0.15 vs 2.28±0.28,P＜0.05;24h:2.24±0.24 vs 2.20±0.19,P＜0.05;48h:2.04±0.44 vs 1.90±0.29,P＜0.05),同时神经元的凋亡亦有增加(31.8±4.40%vs 26.33±5.32%,P＜0.05;24h:25.50±4.03%vs 23.8±5.56%,P＜0.05;48h:22.17±4.52%vs 19.0±4.34%,P＜0.05).侧脑室给予阻断剂EphA4-Fc后,Caspase 3的活性较单纯再灌注组降低(6h:1.73±0.30 vs 2.28±0.28,P＜0.05;24h:1.52±0.26 vs 2.20±0.19,P＜0.05;48h:1.43±0.23 vs 1.90±0.29,P＜0.05),而神经元的凋亡亦明显减少(6h:17.5±4.97%vs 26.33±5.32%,P＜0.05;24h:15.0±4.47%vs 23.8±5.56%,P＜0.05;48h:12.0±3.46%vs19.0±4.34%,P＜0.05),提示ephrinA3-EphA4系统的活化可能参与了再灌注后神经元凋亡的发生.结论 EphA4的活化可能通过激活Caspase 3通路促进了缺血/再灌注后海马脑区神经元的凋亡,阻断EphA4的活化可以抑制Caspase 3的激活,减少海马脑区神经元的凋亡,从而发挥神经保护作用.
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EphA4- ephrinA3系统在海马脑区缺血/再灌注中的表达变化
目的 观察海马EphA4 - ephrinA3的分布特点及在缺血/再灌注过程中的动态变化规律,了解EphA4 - ephrinA3对在海马CA1区神经元迟发性死亡中影响.方法 采用经典的四血管夹闭短暂前脑缺血/再灌注模型,通过TUNEL染色观察缺血/再灌注后6h、24 h、48 h各组海马神经元凋亡情况,同时检测Caspase 3的活性,并以western blot检测EphA4及ephrin A3蛋白表达的变化.结果短暂前脑缺血/再灌注可以引起海马CA1区神经元迟发性死亡.Caspase 3活性在缺血/再灌注后明显升高,再灌注6h、24 h、48 h(OD值分别为2.30±0.19,2.20±0.28,1.90±0.015)与shan组(OD值为1.100±0.017)比较有统计学意义(P＜0.05).大鼠海马组织EphrinA3蛋白表达显著增加,再灌注6h、24 h(IOD值为2.05±0.12 vs 0.78±0.02,P＜0.05),与对照相比有统计学意义,再灌注48 h逐渐回复至对照组水平.EphA4也有缺血诱导的增高,再灌后6h和24 h与对照组相比均有明显增高(2.21±0.12 vs 0.72±0.03,P＜0.05).结论短暂脑缺血/再灌注可诱导海马CA1区ephrinA3与EphA4的表达明显增高,其时间过程与Caspase增高的时间过程一致,提示ephrinA3与EphA4的表达增高可能在CA1区神经元损伤过程中发挥重要作用.
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抗EphA4多肽单克隆抗体的制备及初步应用
目的:制备抗EphA4羧基端多肽的单克隆抗体,研究其免疫学特性.方法:体外合成EphA4羧基端多肽免疫小鼠,运用杂交瘤技术建立抗EphA4多肽单克隆抗体细胞株.通过免疫化学方法分析单抗的免疫学特性.结果:获得1株抗EphA4单克隆细胞,所分泌的抗体具有EphA4特异性,能识别人类、鸡与小鼠EphA4;可用于EphA4的ELISA、免疫沉淀、免疫印迹与免疫组织化学染色.结论:抗EphA4多肽单抗具备优良的免疫学特性,适用于多种免疫化学技术,是EphA4及其配体研究的重要工具.
