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蛋白质转导结构域的研究概况
蛋白质转导结构域是一类能携带生物活性物质并有效穿过多种哺乳动物细胞膜的小分子阳离子多肽，由它介导的蛋白跨膜运动称为蛋白质转导，蛋白质转导是向细胞内快速转运外源性大分子或高极性分子的有效新途径。文章就蛋白质转导结构域的作用特点、跨膜机制和转导过程等内容予以综述。
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PTD-eGFP-△ E250 mFoxp3融合蛋白的表达与穿膜能力鉴定
目的:构建、表达并纯化含有蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)、eGFP的小鼠Foxp3突变体(PTD-eGFP-△E250 mFoxp3)融合蛋白,为研究小鼠Foxp3的功能奠定基础.方法:利用重叠延伸PCR方法构建pET28a-PTD-eGFP-△E250 mFoxp3原核表达载体,并在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中表达此融合蛋白,经Ni2柱纯化,通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜观察其穿膜效率.结果:成功构建了pET28a-PTD-eGFP-△E250 mFoxp3原核表达载体,并表达和纯化了PTD-eGFP-△E250 mFoxp3融合蛋白,流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测结果显示融合蛋白能很好地穿过细胞膜进入细胞内,并定位于细胞质和细胞核.结论:成功制备了具有穿膜活性的PTD-eGFP-△E250 mFoxp3融合蛋白,为更好地研究小鼠Foxp3的功能与特性奠定了实验基础.
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蛋白质转导结构域的跨血脑屏障药物递送
药物递送入脑的主要障碍是血脑屏障,为克服血脑屏障,目前主要采取神经外科手术、增加分子脂溶性、通过内源性血脑屏障转运载体的递送策略.PTD介导跨血脑屏障药物递送是近来出现的新技术,可以方便、高效地使各种分子通过外周血、腹腔等途径,跨越血脑屏障进入脊髓、脑组织细胞.PTD递送快捷、简单、安全,为中枢神经系统疾病的治疗提供了新的研究思路.
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分泌型PTD4-Apoptin融合蛋白诱导HepG2细胞凋亡
目的 研究分泌型的含蛋白质转导结构域的凋亡素(PTD4-Apoptin)融合基因经人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)表达和分泌后,对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响,探讨其用于肝癌治疗的可能性.方法 构建PTD4-Apoptin融合基因的pSecTag2分泌型真核表达载体,并采用脂质体介导将其转染入HUVEC细胞,Western blot检测PTD4-Apoptin融合蛋白的表达及分泌,转染48 h后收集培养上清作为条件培养液,用于HepG2、L02细胞培养,共培养24 h后,采用Western blot检测细胞内和核内Apoptin的含量,流式细胞术检测细胞凋亡.结果 瞬时转染pSecTag2-PTD4-Apoptin的HUVEC细胞可表达及分泌PTD4-Apoptin融合蛋白,其培养上清中的PTD4-Apoptin融合蛋白可有效进入HepG2和L02细胞,并可在HepG2细胞核内聚积,显著诱导HepG2细胞凋亡达47.4%(P＜0.001),而对L02细胞无此效应.结论 HUVEC细胞表达分泌的PTD4-Apoptin融合蛋白可显著诱导邻近HepG2细胞凋亡,而对L02正常肝细胞无损伤.
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利用蛋白质转导结构域进行生物大分子的胞内转运
由于细胞膜的存在限制了生物利用度,大分子物质的胞内转运还存在许多问题.近通过对蛋白质转导结构域的研究已经排除了这一障碍.应用蛋白质转导结构域将大分子蛋白质、核酸、病毒、小分子物质转运到目标细胞内已引起了人们越来越多的关注.虽然十年前就发现了蛋白质转导结构域,如触足蛋白、Tat及Vp22,但其作用机制刚刚明确并开始被广泛的应用.除了富含精氨酸的蛋白质转导结构域,我们通过流式细胞光密度的测定和酶的测定,还发现赖氨酸同聚物也能够介导许多细胞的转导过程.蛋白质转导结构域,有天然存在的和人工合成的,已越来越广泛的应用于将生物活性物质转运到细胞内以便更好的治疗某些疾病,如癌症、中风、关节炎等等.
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腺病毒介导的NT4p53(N15)Ant异源融合基因对肝癌细胞的杀伤作用
目的 构建包括神经营养因子4(NT4)信号肽,p53氨基端短活性肽(12～26位氨基酸)及蛋白质转导结构域-黑腹果蝇触足肽(Ant)序列在内的异源融合基因,并以腺病毒作为基因转移载体观察NT4p53(N15)Ant基因在体外对肝癌细胞系HepG2的杀伤效应.方法 应用互为模板的引物PCR技术及T载体克隆法获得p53(N15)Ant基因克隆,经酶切后连入pBV220/NT4质粒,再将融合基因NT4p53(N15)Ant亚克隆至腺病毒的穿梭质粒内,与辅助质粒pJM17共转染HEK293细胞,通过同源重组获得重组腺病毒,经PCR鉴定后,NT4p53(N15)Ant重组腺病毒感染HepG2细胞,用MTT比色法和PI染色流式细胞计数仪分析Ad.NT4p53(N15)Ant对肿瘤细胞和正常细胞的杀伤效应及凋亡率.结果 克隆出NT4p53(N15)Ant基因,得到高滴度的重组腺病毒,提取病毒DNA经PCR证实含目的基因.MTT测定结果显示,与平行对照病毒Ad.GFP相比,Ad.NT4p53(N15)Ant对HepG2细胞有强烈的杀伤效应,且以病毒感染后48 h作用为明显,对肿瘤细胞抑制率达到63.3%,而对正常细胞NIH3T3的影响很小.Ad.NT4p53(N15)Ant感染HepG2细胞30 h后的流式细胞仪分析结果显示:Ad.NT4p53(N15)Ant可使HepG2细胞发生凋亡,凋亡率为18.16%.结论 通过分子克隆体外重组技术我们首次成功制备了NT4p53(N15)Ant复制缺陷型重组腺病毒;初步的研究发现Ad.NT4p53(N15)Ant对HepG2细胞有强烈的杀伤效应,这种效应部分是通过诱导HepG2细胞的凋亡而实现的.
关键词： 神经营养因子4信号肽 P53 蛋白质转导结构域 腺病毒载体 HepG2细胞 -
一种基于HIV-1 TAT蛋白质转导结构域细胞内转导系统的成功改建
目的探索本室构建的pET14b-His-TAT-Flag重组载体表达的融合蛋白在细胞中转导效率低的原因,建立高效的细胞内转导系统.方法通过PCR方法去除原有载体中的Flag序列,在改建正确的pET14b-His-TAT重组载体基础上插入EGFP编码序列,将经酶切、DNA测序鉴定正确的pET14b-His-TAT-EGFP质粒转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达、SDS-PAGE鉴定正确,再经蛋白透析、过滤处理.将His-TAT-EGFP融合蛋白加入ECV304细胞中,用荧光显微镜观察.结果重组质粒pET146-His-TAT融合表达载体和pET14b-His-TAT-EGFP重组载体经酶切、DNA测序鉴定证实构建成功.表达纯化出了高纯度His-TAT-EGFP融合蛋白并具有较高细胞内转导活性.结论成功改建pET14b-His-TAT-Flag重组载体,正确构建pET14b-His-TAT-EGFP载体,His-TAT-EGFP融合蛋白高效表达,并具有明确的细胞内转导活性.
关键词： HIV-1反式激活因子 蛋白质转导结构域 融合蛋白 细胞内转导 -
TAT-乙肝病毒靶向核糖核酸酶融合蛋白原核载体的构建及表达
目的: 构建蛋白质转导结构域(protein transduction domain, PTD)TAT和乙肝病毒靶向核糖核酸酶(targeted ribonuclease, TR)融合蛋白的原核表达载体, 并在大肠杆菌中表达. 方法: 将已构建的乙肝病毒靶向核糖核酸酶基因、乙肝病毒核心蛋白(HBV core protein, HBVc)基因、人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素(human eosinophil derived neurotoxin, hEDN)基因, 克隆入含PTD TAT的pTAT原核表达载体, 在大肠杆菌BL21(DE3)LysS 内, 以IPTG诱导融合蛋白表达.表达产物用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定.结果: 成功地构建了乙肝病毒靶向核糖核酸酶及其两个对照的融合蛋白原核表达载体, 并在IPTG诱导下获得特异性表达. 结论: Tat-乙肝病毒靶向核糖核酸酶融合蛋白的构建, 为体内应用靶向核酸酶治疗乙型肝炎奠定了基础.
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含PTD结构域的MAGE－A3融合蛋白表达、纯化及生物学功能的初步研究
【目的】构建、表达并纯化含有蛋白转导结构域TAT的黑色素瘤相关基因MAGE－A3融合蛋白TAT－MAGE－A3－EGFP，并观察其生物学功能，【方法】1）构建质粒pET28a－TAT－MAGE－A3－EGFP、对照组pET28a－MAGE－A3－EGFP和pET28a－TAT－EGFP原核表达载体，在大肠埃希菌BL21（DE3）中表达，经SDS－PAGE电泳和Western Blot鉴定并通过Ni＋柱纯化获得TAT－MAGE－A3－EGFP、MAGE－A3－EGFP、TAT－EGFP三种融合蛋白；2）动态荧光显微镜观察MAGE－A3、TAT－MAGE－A3－EGFP、TAT－EGFP三种融合蛋白在细胞中的不同分布，流式细胞术观察三种融合蛋白穿膜效率的差异。【结果】1）成功构建了pET28a－TAT－MAGE－A3－EGFP、pET28a－MAGE－A3－EGFP和pET28a－TAT－EGFP原核表达载体，并获得了TAT－MAGE－A3－EGFP、MAGE－A3－EGFP和TAT－EGFP融合蛋白。2）动态荧光显微镜和流式细胞术显示TAT－MAGE －A3－EGFP与MAGE－A3－EGFP相比能更高效地穿过细胞膜进入细胞内，并定位于细胞质和细胞核，且与TAT－EGFP相比穿膜效率区别不大。【结论】TAT－MAGE－A3－EGFP融合蛋白可在原核表达系统中高效表达，并具有高效穿透细胞膜能力，且带有PTD结构的融合蛋白穿膜能力与分子量无直接关系。
