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NEDD4-1 shRNA真核表达质粒的构建和鉴定
目的:设计并构建靶向NEDD4-1基因shRNA真核表达质粒.方法:依据靶基因序列没计siRNA,克隆人pGPU6/GFp/Neo载体U6启动子的下游,建立shRNA表达质粒系统.采用酶切法和测序法进行鉴定.结果:将重组NEDD4-1shRNA用BamH I和Pst I内切酶分别单酶切.经酶切鉴定、测序分析,序列完全正确.结论:成功构建NEDD4-IghRNA真核表达质粒.为进一步研究NEDD4-1在胶质瘤发生和发展中的作用提供实验基础.
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NEDD4-1对前列腺癌PC3细胞TrkA泛素化的影响
目的 检测前列腺癌PC3细胞中泛素连接酶NEDD4-1 (neural precursor cell expressed developmentally downregulated 4-1,NEDD4-1)对酪氨酸蛋白激酶A(tyrosine kinase A,TrkA)泛素化作用的研究,探讨NEDD4-1调节前列腺癌PC3细胞侵袭及迁移的机制.方法 采用脂质体瞬时转染法将NEDD4-1质粒转染入前列腺癌PC3细胞中,应用蛋白免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)结合免疫印迹(immunoblotting,IB)法,观察外源的NEDD4-1和TrkA的相互作用;共表达NEDD4-1和ubiquitin,用Co-IP结合IB法检测NEDD4-1对TrkA的泛素化作用;共表达NEDD4-1和ubiquitin的同时,用蛋白酶体抑制剂MG132处理,观察TrkA水平的改变.结果 转染NEDD4-1质粒后,外源性表达的NEDD4-1可与TrkA共沉淀;共表达NEDD4-1和ubiquitin后,NEDD4-1对内源的TrkA有泛素化作用,TrkA能与泛素共沉淀;共表达NEDD4-1和ubiquitin,用蛋白酶体抑制剂MGl32处理后,TrkA的泛素化降解被抑制.结论 在前列腺癌PC3细胞中,TrkA是NEDD4-1的底物之一;NEDD4-1可调节TrkA的泛素化作用,促进其在蛋白酶体降解.
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NEDD4-1基因在病理性瘢痕中的表达及意义
目的研究NEDD4-1基因在正常皮肤与增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中的表达情况,探讨其在病理性瘢痕发病机制中的作用。方法收集临床标本30例,其中增生性瘢痕10例(A组)、瘢痕疙瘩10例(B组)、正常皮肤10例(C组),采用Western blot 法和普通 RT-PCR 方法检测 A、B、C 3组中NEDD4-1蛋白和mRNA表达情况,并进行统计学分析。结果在A、B组中,NEDD4-1 mRNA和蛋白均可表达,但表达差异无统计学意义(P>0.05),两组分别与C组比较,差异无统计学意义( P>0.05)。结论 NEDD4-1基因在病理性瘢痕中均可表达,但NEDD4-1的表达与病理性瘢痕的发生机制之间的关系仍需进一步研究。
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PTEN与脑胶质瘤的研究进展
PTEN早于1997年由3个研究小组同时克隆[1],分别命名为与张力蛋白同源、第10染色体丢失的磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN) 基因;多种进展期癌中发生突变的基因;TGF-β调节的、上皮细胞富含的磷酸酶基因,现统称为PTEN.
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介导抑癌蛋白泛素化的新分子
抑癌蛋白泛素化机制在肿瘤发生发展过程中扮演重要角色.其中,NEDD4-1介导的PTEN泛素化与Cowden综合征密切相关,Livin介导的Smac/DIABLO泛素化,以及癌性锚蛋白重复序列、转录因子E4F1等介导的P53泛素化均在肿瘤发生过程中扮演重要角色.近期研究表明,这些介导抑癌蛋白泛素化的新分子有望成为肿瘤治疗的靶点.
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NEDD4-1shRNA对U251胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响
目的 探讨NEDD4-1 shRNA对U251胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响.方法 构建NEDIM-1 shRNA表达载体.以不同比例质粒和脂质体转染U251细胞,通过荧光显微镜观察细胞存活情况,优化转染效率.转染48 h后采用Western blot、RT-PCR分别检测NEDD4-1蛋白及mRNA的表达,流式细胞术检测细胞周期,MTT法检测细胞增殖,DAPI荧光染色检测细胞凋亡.结果 NEDD4-1 shRNA表达载体构建成功.脂质体与质粒的佳转染效率比例为2.5 μl:1 μg,48 h转染效率在60%～700.与对照组比较,转染NEDD4-1 shRNA后,U251胶质瘤细胞NEDD4-1的蛋白及mRNA表达水平均下降(均P<0.05),细胞大多停滞在G<,0>-G<,1>期(均P<0.05),增殖率明显降低(均P<0.05),凋亡率显著增加(均P<0.05).结论 NEDD4-1作为PTEN泛素连接酶,为胶质瘤基因治疗提供靶点.
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肿瘤抑制基因PTEN研究新进展
PTEN是具有磷酸酶活性的抑癌基因,其低表达或缺失与肿瘤的进展及不良预后密切相关,其抑制肿瘤作用机制系通过抑制PI3K/AKT信号通路,FAK/PI30C和MAPK信号通路,FRAP/Mtor信号通路及影响核转录因子-Kb/IB信号通路;另外,NEDD4-1通过泛素化蛋白体降解途径调节PTEN,BMP通过RAS/ERK信号通路抑制PTEN表达,IGF-1通过IGF-1/PI3K/Akt信号通路调节PTEN.
