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膀胱平滑肌细胞乙酰胆碱M3受体干扰RNA慢病毒载体的构建
目的 构建膀胱平滑肌细胞(bladderSmoothmusclecllS,BSMCS)M3型受体干扰RNA慢病毒载体.方法 合成4条M3受体干扰序列,构建GV118-Sh-M3慢病毒载体,测序验证序列.将GV118-sh-M3慢病毒载体与质粒pHelperl.0、pHelper 2.0三个载体共转染293T细胞,收集病毒颗粒并用荧光法检测4组病毒滴度.体外原代培养BSMCs,4组GV118-sh-M3慢病毒(KD1、KD2、KD3和KD4)转染BSMCs,观察绿色荧光蛋白表达并通过RT-PCR、Western blotting法检测各组干扰效率.结果 成功构建4个GV118-sh-M3慢病毒载体,测序结果符合设计序列.4组GV118-sh-M3慢病毒滴度分别为2 × 108、6 × 108、5 × 108和5 × 108TU/mL.分别转染BSMCs后,KD1组绿色荧光蛋白表达量高且干扰效率高.结论 成功包装并筛选了 GV118-sh-M3慢病毒载体,为后续进一步研究干扰M3受体在神经源性膀胱中的作用奠定了基础.
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M3型乙酰胆碱受体对血管平滑肌细胞Ⅰ型胶原蛋白的表达及机制
目的 探讨M3型乙酰胆碱受体(M3R)对血管平滑肌细胞Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)表达影响及其机制.方法 体外培养A7r5大鼠主动脉平滑肌细胞株,Western blot法测定COL-Ⅰ、细胞外信号调节激酶1/2 (ERK1/2)、磷酸化ERK1/2 (p-ERK1/2)和转化生长因子-β1 (TGF-β1)表达.结果 乙酰胆碱(Ach 1.0×10-7、1.0x10-6、1.0×10-5 mol/L,2h)呈浓度依赖性促进COL-Ⅰ的表达(P＜0.05),M3R特异性阻断剂4-DAMP抑制Ach(1.0×10-6mol/L)介导COL-Ⅰ表达(1.302±0.181比1.892±0.292,P＜0.05);M3R促进p-ERK1/2表达上调(165％,P＜0.05),ERK1/2特异性抑制剂U0126抑制M3R介导的COL-Ⅰ表达(1.421±0.176比1.912±0.190,P＜0.05);M3R促进TGF-β1的表达(194％,P＜0.05),TGF-β1特异性抑制剂SB431542抑制M3R介导的p-ERK1/2表达上调(1.121 ±0.059比1.875±0.078,P＜0.05).结论 M3R通过激活TGF-β1-ERK1/2信号通路促进COL-Ⅰ的表达.
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M3型乙酰胆碱受体对心脏成纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白的表达及机制
目的 探讨M3型乙酰胆碱受体(M3R)对心脏成纤维细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达影响及其机制.方法 体外分离培养大鼠心脏成纤维细胞,Western blot法测定α-SMA、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38)、磷酸化p38(p-p38)和Ras相关C3肉毒素底物1(Rac1)的表达;谷胱甘肽巯基转移酶沉淀实验(GST Pull-down)法检测Rac1的活性.结果 乙酰胆碱(1.0×10-7、1.0×10-6、1.0×10-5 mol/L,2h)呈浓度依赖性促进α-SMA的表达上调(P＜0.05),M3R特异性阻断剂4-二苯乙酰氧基-N-甲基-哌啶(4-DAMP)抑制乙酰胆碱(Ach)介导的α-SMA表达上调(1.432±0.093比2.534±0.241,P＜0.05);M3R促进p-p38表达上调(171％,P＜0.05),p38特异性抑制剂SB203580抑制M3R介导的α-SMA表达上调(1.614±0.128比2.873±0.193,P＜0.05);M3R活化Rac1(182％,P＜0.05),Rac1特异性抑制剂NSC23766抑制M3R介导的p-p38表达上调(1.301±0.154比1.821±0.113,P＜0.05).结论M3R通过激活Rac1-p38信号通路促进心脏成纤维细胞α-SMA的表达.
