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去甲斑蝥素作用早期对人肝癌细胞活性氧及NF-E2相关因子2/抗氧化反应元件信号通路的激活
目的：探究去甲斑螯素（NCTD）诱导人肝癌HepG2细胞凋亡及G2/M期阻滞的早期事件，分析NCTD作用早期HepG2细胞内活性氧自由基（ROS）的变化规律及NCTD对NF-E2相关因子/抗氧化反应元件（Nrf2/ARE）信号通路的影响。方法 NCTD30，60和120μmol · L-1分别作用于体外培养的人肝癌HepG2细胞3，6，12，24，48和72 h，MTT法检测NCTD对细胞存活的影响；流式细胞术检测NCTD 60μmol·L-1作用细胞12，24和48 h对细胞周期和细胞凋亡的影响；DCFH-DA探针结合流式细胞术检测NCTD 30，60和120μmol·L-1作用于3，6和12 h对HepG2细胞内ROS的影响；荧光素酶法测定NCTD同时转染ARE和荧光素酶报告基因的HepG2C8细胞的荧光强度；实时荧光定量PCR检测对血红素氧合酶-1（HO-1）和醌氧化还原酶-1（NQO1）mRNA表达的影响。结果 NCTD 30，60和120μmol·L-1作用3和6 h对HepG2细胞存活无明显影响，而作用24，48和72 h对HepG2细胞有明显生长抑制作用（P<0.01）；NCTD 60μmol·L-1作用12 h后可诱导HepG2细胞发生凋亡及G2/M期阻滞，12，24和48 h凋亡细胞比例分别由12 h细胞对照组（4.00±1.98）%增加到（12.10±1.70）%，24 h对照组（4.05±0.21）%增加到（31.80±6.50）%，48 h对照组（3.90±0.85）%增加到（33.30±1.41）%；12，24和48 h G2/M期细胞比例分别由12 h对照组的（16.51±1.58）%增加到（40.89±0.18）%，24 h对照组的（16.99±1.32）%增加到（55.29±3.99）%，48 h对照组的（14.45±0.59）%增加到（50.66±5.88）%，相应各时相NCTD处理组G1期细胞比例明显下降（P<0.01）；NCTD 30，60和120μmol·L-1作用HepG2细胞3，6和12 h，ROS无明显变化，作用HepG2C8细胞6和12 h可明显激活Nrf2/ARE信号通路，下游基因HO-1和NQO1 mRNA表达显著上调（P<0.05）。结论NCTD作用HepG2细胞早期可明显激活Nrf2/ARE信号通路；ROS激活可能不是NCTD诱导人肝癌HepG2细胞凋亡及G2/M期阻滞的主要原因。
