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HLH缺失型Id2候选相互作用蛋白
目的:筛选可以与螺旋-环-螺旋(HLH)结构域缺失的Id2相互作用的蛋白.方法:用重叠延伸PCR方法将Id2中的HLH结构域缺失,并插入到pGBKT7载体,构建 BD∶ Id2-DBM-δHLH融合诱饵质粒;构建MCF-7细胞的ds cDNA文库;采用共转化方法进行Id2-DBM-δHLH相互作用蛋白的酵母双杂交筛选,采用PCR方法扩增阳性克隆中的AD∶ cDNA序列并测序;将获得的AD∶ cDNA质粒分别与BD∶ Id2-DBM-δHLH诱饵质粒共转化酵母进行配对验证.结果:酵母双杂交方法共筛选到19个阳性克隆,PCR方法在这19个克隆中共扩增到28条片段,序列测定证实含18个不同的基因,对其中的13个进行配对验证后证实了其中8个与HLH缺失型Id2相互作用,这8个基因分别是:UXT、VIM、KRT7、FHL2、SEI1、PCBP1、SIVA和LSM2.结论:本研究首次利用HLH缺失型Id2作为诱饵,利用酵母双杂交技术筛选识别了一族新的Id2相互作用蛋白,为进一步研究Id2的功能调控以及非HLH依赖的功能活性奠定基础.
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NeuroD对细胞分化的影响
神经源性分化蛋白(neurogenic differentiation,NeuroD)早是通过酵母双杂交分析系统克隆出的一个新的碱性螺旋-环-螺旋(basic Helix-loop-helix,bHLH)家族成员[1].
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ID蛋白与细胞分化、细胞周期调控及肿瘤的发生
ID(inhibitors of DNA binding)蛋白具有螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix,HLH)结构,缺乏DNA结合域,可与一些转录因子(主要是bHLH蛋白)形成非活性异二聚体,使其不能与DNA上的E基序结合,从而负向调控细胞分化,因而被称为"分化抑制因子"(inhibitor of differentiation)[1].在哺乳动物细胞中,ID蛋白由ID 1～4四个亚型构成,其功能不尽相同,它们在细胞发育、周期调控及肿瘤发生等方面有重要作用[2].
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果蝇Tap蛋白结构与功能的生物信息学分析
目的 利用生物信息学方法分析果蝇Tap蛋白的结构和功能.方法 基于NCBI数据库中果蝇Tap蛋白的氨基酸序列,从蛋白质理化性质、跨膜区、信号肽、亚细胞定位、结构域、三维结构及物种间同源蛋白进化关系等方面进行分析.结果 Tap蛋白为不稳定亲水性蛋白,无跨膜区和信号肽,在细胞核中发挥生物学效应,具有碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)结构域.Tap蛋白与来源于NeuroD1的模板2ql2.1.B有61.02％的氨基酸序列一致,Tap蛋白与人类和啮齿动物的编码产物高度同源,在系统发生树中距离近.结论 果蝇Tap蛋白具有bHLH蛋白家族的典型结构,可能在果蝇胚胎发育早期的神经发生、分化等过程中发挥作用.
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Id2 通过非 HLH 结构域促进 MCF-7 细胞的侵袭性
目的:观察 Id2 基因转染乳腺癌细胞 MCF-7 后对细胞生长、侵袭能力的变化,探讨 Id2 基因缺失HLH 结构域后对细胞的影响.方法:以携带 Id2-DBM 和 Id2-DBM-BHLH 基因的质粒(pCDNA3.1-Id2-DBM 和 pCDNA3.1-Id2-DBM-SHLH) 经脂质体介导转染 MCF-7 细胞.RT-PCR 法检测转染后Id2、Id2-DBM 和 Id2-DBM-SHLH mRNA 表达水平;MTT 法检测 MCF-7 细胞增殖曲线;划痕实验、transwell 小室检测细胞的迁移能力;Western Blot 分析 Id2 对 MCF-7 细胞 E-cad 表达的影响.结果:mRNA 水平显示质粒均成功转入;细胞生长曲线显示增殖无显著差异;与空载组比较,转染 pCDNA3.1-Id2-DBM 和 pCD-NA3.1-Id2-DBM-SHLH 后侵袭能力增强,且 E-cad 表达降低.结论:Id2 蛋白的过表达可以促进乳腺癌细胞 MCF-7 的侵袭能力,与 E-cad 的降低有关,且该作用在缺失 HLH 结构域后仍然存在.
