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人HUT78细胞褪黑素受体的基因与蛋白表达的研究
为了检测人HUT78细胞是否存在褪黑素受体(melatonin receptor,MR)及其亚细胞分布特点,采用异硫氢酸胍-苯酚-氯仿一步法抽提总RNA,进一步通过RT-PCR方法检测MR亚型mt1和MT2的mRNA,并将RT-PCR的阳性产物通过自动测序仪测序;同时应用免疫组化染色方法检测mt1和MT2受体亚型蛋白在HUT78细胞内的分布特点.RT-PCR方法则得到了368bp mt1 cDNA片段,无321bp MT2 cDNA片段,同时将mt1阳性条带通过胶回收、测序,结果显示扩增产物与人mt1受体亚型的基因序列相吻合;免疫组化结果显示,人HUT78细胞存在mt1受体蛋白,主要分布于细胞膜和细胞浆,呈棕褐色阳性颗粒,而细胞核上未见阳性颗粒,MT2受体蛋白则未检出.提示褪黑素(melatonin,Mel)对T淋巴细胞具有直接调节作用,为研究生理及病理情况下Mel调节免疫系统的作用机制奠定了基础.
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西达本胺联合姜黄素对人皮肤T细胞淋巴瘤细胞系Hut78的影响及其分子机制
目的 研究西达本胺联合姜黄素对皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用,探讨西达本胺联合姜黄素治疗CTCL的机制.方法 分别用0.3、0.6、1.2、2.4 μmol/L西达本胺,10 μmol/L姜黄素,1.2 μmol/L西达本胺联合10 μmol/L姜黄素处理Hut78细胞24、48、72 h后,采用MTS法检测Hut78细胞的生存率.用0.6、1.2 μmol/L西达本胺,10μmol/L姜黄素,1.2μmol/L西达本胺联合10 μmol/L姜黄素分别处理Hut78细胞24 h,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况及细胞周期,用实时PCR和Western印迹法检测凋亡相关基因Fas、caspase 8、NF-κB p65及细胞周期相关基因P21、CDK2、细胞周期蛋白E(cyclin E)mRNA和蛋白的表达.统计分析采用重复测量方差分析、单因素方差分析和LSD-t检验.结果 西达本胺能明显抑制Hut78细胞的增殖,且呈剂量依赖性(F=266.558,P＜ 0.001)和时间依赖性(F=564.966,P＜ 0.001).培养48 h和72 h时,1.2 μmol/L西达本胺联合10 μmol/L姜黄素对细胞增殖的抑制作用显著强于1.2 μmol/L西达本胺及10 μmol/L姜黄素(均P＜ 0.001).流式细胞仪结果显示,联合组的凋亡细胞比例均显著高于0.6、1.2 μmol/L西达本胺组和10 μmol/L姜黄素组(均P＜0.001).此外,联合组和1.2 μμmol/L西达本胺组G0/G1期细胞比例明显高于0.6μμmol/L西达本胺组和10 μmol/L姜黄素组,而其S期细胞比例及G2/M期细胞比例均明显低于0.6 μmol/L西达本胺组和10 μmol/L姜黄素组(均P＜0.05),联合组与1.2 μmol/L西达本胺组各细胞周期比例差异均无统计学意义(均P＞ 0.05).实时PCR结果显示,联合组和1.2 μmol/L西达本胺组Fas、caspase 8、P21 mRNA的表达均明显高于0.6 μmol/L西达本胺组和10 μmol/L姜黄素组(均P＜0.001),而其NF-κB p65、CDK2、cyclin EmRNA的表达均明显低于0.6 μmol/L西达本胺组和10 μmol/L姜黄素组(均P＜ 0.001).联合组Fas mRNA的表达明显高于1.2 μmol/L西达本胺组(P＜ 0.001),而caspase 8、P21、NF-κB p65 、CDK2、cyclin E mRNA的表达与1.2 μmol/L西达本胺组差异无统计学意义(均P＞0.05).Western印迹结果显示,联合组与0.6、1.2 μmol/L西达本胺、不加药物的对照组比较,Fas、caspase 8、P21蛋白的表达明显增加,而NF-κB p65、CDK2、CyclinE蛋白的表达明显降低,与以上基因mRNA的表达一致.结论 西达本胺通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡来抑制CTCL细胞系Hut78生长,联合姜黄素能明显提高抑制CTCL细胞系Hut78的生长率.
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阿维A与干扰素对人皮肤T细胞淋巴瘤细胞株Hut78细胞增殖及白细胞介素15表达的影响
目的：检测不同浓度阿维A、干扰素α（IFN?α）单独或联合应用对人皮肤T细胞淋巴瘤Hut78细胞株的增殖抑制作用及白细胞介素15（IL?15）表达的影响。方法将Hut78细胞分为空白对照组、阴性对照组、二甲基亚砜组（DMSO）和实验组，其中实验组分别用0.1~10μmol/L阿维A和5000~20000 IU/ml IFN?α单独或1.0μmol/L阿维A联合5000~20000 IU/ml IFN?α作用Hut78细胞，培养24、48、72 h后分别进行测定。CCK8法检测细胞增殖情况，ELISA检测药物处理后细胞的白细胞介素15（IL?15）表达情况。结果各浓度阿维A或联合作用组与DMSO组相比及IFN?α组与阴性对照组相比，Hut78细胞增殖和IL?15表达均受到明显抑制，抑制作用随浓度增加和时间延长而增强。重复测量方差分析显示，阿维A、IFN?α单独或联合作用不同时间，细胞增殖抑制率和IL?15表达差异均有统计学意义（P<0.05），不同作用浓度之间差异亦有统计学意义（均P<0.05），作用时间与药物浓度之间存在交互作用（均P<0.05）。1.0μmol/L阿维A＋10000或20000 IU/ml IFN?α组与相应浓度药物单独作用组比较，细胞抑制率差异在24、48、72 h时均有统计学意义（P<0.05）。1.0μmol/L阿维A+5000 IU/ml IFN?α组在24、48、72 h时与5000 IU/ml IFN?α组相比，IL?15表达差异均有统计学意义（P<0.05）；1.0μmol/L阿维A＋10000或20000 IU/ml IFN?α组与相应浓度药物单独作用组之间IL?15表达差异在24、48、72 h时均有统计学意义（P<0.05）。结论阿维A和IFN?α均对Hut78细胞的增殖有抑制作用，均可下调Hut78细胞IL?15的表达，这种作用随着浓度的增加和时间的延长而增强，且两者联合用药优于单独用药。
