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小鼠牙乳头来源MDPC-23细胞自发形成的类破牙细胞鉴定
目的：探寻小鼠牙乳头来源MDPC?23细胞自发形成的体外破牙细胞的培养方法。方法 MDPC?23细胞常规培养6 d，利用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色法与RANKL诱导RAW 264.7细胞形成的破骨细胞相比较；金相显微镜及扫描电镜（SEM）观察牙本质片上细胞形态及吸收陷窝形成情况；免疫荧光染色观察丝状肌动蛋白（F?actin）细胞骨架结构；免疫印迹、免疫荧光和（或） ELISA法检测破牙细胞形成相关蛋白RANKL、RANK、TRAF6以及破牙细胞标志蛋白TRAP、组织蛋白酶K（Cathepsin K）的表达情况。Cathepsin K和TRAP蛋白表达的灰度值比较采用两独立样本的t检验进行统计；0、2、4、6 d四个时间点RANKL分泌水平的比较采用方差分析进行统计分析。结果MDPC?23细胞常规培养6 d可自发形成少量TRAP染色阳性的多核巨细胞，其形态有别于RAW 264.7细胞形成的破骨细胞；自发形成的多核巨细胞仅能在牙本质片上形成少量较浅的吸收陷窝；免疫荧光结果显示，自发形成的类破牙细胞具有破牙细胞特征性丝状肌动蛋白环结构；免疫印迹、免疫荧光和（或）ELISA结果表明，MDPC?23细胞体外常规培养下表达RANK、TRAF6蛋白并自分泌RANKL，第0、2、4、6天RANKL分泌水平总体差异有统计学意义（F=5.373，P=0.026），第2天RANKL分泌水平较第0天增加（P=0.007）；第6天TRAP及Cathepsin K蛋白表达上调（tTRAP=5.033，PTRAP=0.0024；tCathepsin K=12.95，PCathepsin K=0.0002）。结论 MDPC?23细胞体外常规培养下可自发形成少量吸收能力较弱的TRAP染色阳性的多核巨细胞，具有特征性肌动蛋白环结构，同时能上调破牙细胞特征性蛋白TRAP和Cathepsin K表达，自分泌RANKL并表达RANK、TRAF6蛋白，是与成熟破牙细胞形态、结构及蛋白表达相似的类破牙细胞。
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RNAi对成牙本质细胞表达TRAF6干涉作用
目的 采用针对小鼠肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)的siRNA真核表达载体,探讨其对小鼠成牙本质细胞样细胞MDPC-23中表达TRAF6的干涉作用.方法 将构建成功的2个针对TRAF6基因的siRNA真核表达载体( pSUPER-T和pSUPER-2T),通过脂质体介导瞬时转染MDPC-23细胞,RT-RCR和Western blot法检测其对转染后细胞中TRAF6的mRNA和蛋白表达干涉效果.结果 pSUPER-T和pSUPER-2T转染MDPC-23细胞后,RTRCR法显示2组TRAF6 mRNA表达下调、Westem blot结果表明2组TRAF6蛋白表达水平降低,其中pSUPER-2T转染组抑制TRAF6表达作用较强.结论 针对TRAF6的siRNA真核表达载体,在MDPC-23细胞中有效发挥了TRAF6表达干涉作用.
关键词： RNA干涉 肿瘤坏死因子受体相关因子6 MDPC-23细胞 -
牙本质磷蛋白mRNA原位杂交方法的建立
目的:建立检测牙本质磷蛋白(DPP)mRNA表达的原位杂交方法.方法:选用发育各阶段的牙胚、牙齿和体外培养的MDPC-23成牙本质细胞为对象,采用地高辛标记的寡核苷酸探针的原位杂交方法.结果:DPP mRNA在牙胚与牙齿中的成牙本质细胞、前成釉细胞和体外培养的成牙本质细胞存在阳性表达.结论:设计的探针敏感性高,特异性高,所建立的原位杂交方法是研究牙本质发育和损伤修复的良好方法.
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TGF-β1对MDPC-23细胞DPP表达调控的体外研究
目的:研究转化生长因子β1(TGF-β1)对成牙本质细胞表达DPP的调控作用.方法:给体外细胞培养的 MDPC-23 成牙本质细胞不同浓度的TGF-β1刺激,利用原位杂交的方法观察细胞内DPP mRNA 的变化,所得结果进行图像分析和统计处理.结果:TGF-β1刺激前后的成牙本质细胞均表达DPP mRNA,但刺激后的成牙本质细胞DPP mRNA表达下降,不同浓度TGF-β1刺激成牙本质细胞后DPP mRNA表达程度不等.结论:外源性TGF-β1下调成牙本质细胞表达DPP,并有浓度差异.
