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喉癌Hep-2细胞来源的exosomes提取和鉴定
目的 观察喉癌Hep-2细胞能否分泌exosomes,并从形态学角度鉴定.方法 大量培养喉癌Hep-2细胞,热休克处理,收集培养上清液.通过3/0.8 μm深层过滤小型滤芯对上清液进行预处理,去除直径较大的颗粒和杂质,利用超滤离心技术联合蔗糖密度梯度离心法,将上清液浓缩提纯,透射电镜对exosomes做鉴定.结果 成功从喉癌Hep-2细胞培养上清液中分离提取出exosomes,电镜下观察exosomes呈圆形或椭圆形双层膜的囊泡状结构,直径约20～ 100 nm,密度较高,分散均匀.结论 较先发现喉癌细胞自身能分泌exosomes,为喉癌免疫治疗做新的探求.
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超滤离心法测定连翘酯苷脂质体包封率
目的:建立连翘酯苷脂质体包封率的测定方法.方法:通过逆相蒸发法制备连翘酯苷脂质体,运用超滤离心法测定其包封率.结果:超滤离心法能快速有效的对脂质体与游离药物进行分离,游离药物平均回收率在98.75％～101.71％之间,超滤加样回收率在95.67％～98.76％之间;此法测定3批样品,所得包封率为72.77％～74.07％,RSD为0.56％～1.77％.结论:超滤离心法操作简单、快速,可用于连翘酯苷脂质体包封率的测定.
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硫酸长春新碱热敏脂质体的制备和质量评价
目的 制备硫酸长春新碱(vincristine,VCR)热敏脂质体,测定其粒径及体外释药热敏特性,建立脂质体含量、包封率及有关物质的测定方法.方法 pH梯度主动载药法制备长春新碱热敏脂质体,激光粒度分析仪测定脂质体粒径;以水为释放介质,分别考察脂质体在37和42℃的释放特性;超滤离心法测定脂质体包封率;HPLC测定脂质体中长春新碱的含量及有关物质.结果 长春新碱热敏脂质体的平均粒径为(86 ±6) nm,37℃几乎不释放,42℃30 min内释放约90％;3批样品包封率均高于95％;含量为1.92 mg· mL-1,有关物质符合药典要求.结论 长春新碱长循环热敏脂质体的制备工艺简单稳定,所制备的脂质体粒径均一,具有明显的热敏特性,包封率高,适于-20℃长期储存.脂质体含量、包封率及有关物质测定方法简便、快速、准确.
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胚胎干细胞来源的微囊体分离提取及促造血作用的观察
目的 探讨分离提取及鉴定胚胎干细胞(ESC)产生的微囊体(MV)的实验方法,初步研究其促造血的生物学作用.方法 利用超滤离心的方法从小鼠ESC 培养上清液中分离提纯MV(ES-MV),以小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)培养上清来源的MV(MEF-MV)为对照;采用透射电镜形态学观察,RT-PCR 检测特异性基因表达的方法对ES-MV 进行鉴定;将ES-MV 用于环磷酰胺所致骨髓抑制小鼠,通过骨髓涂片初步观察其对造血的恢复作用.结果透射电镜下观察,ES-MV呈明显异质性的圆形或椭圆形小囊泡,直径约30 nm~1 μm 不等,有完整的包膜,内为低电子密度物质.RT-PCR 方法从ES-MV 中可检测到Oct-4、Wnt-3、Hoxb4 基因的表达,而MEF-MV 内不能检测到这些基因的表达;将ES-MV 用于骨髓抑制小鼠后,骨髓涂片显示成熟红细胞和有核细胞比例明显升高.结论 ESC 可以产生MV,并且是MV 的丰富来源;超滤离心法是一种方便实用的提取ES-MV 的方法;ES-MV 对促进骨髓造血有一定的作用.
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固相萃取-超滤离心-离子色谱法测定冰淇淋和雪糕中的硫氰酸盐
目的 建立冰淇淋和雪糕中硫氰酸盐的离子色谱测定方法.方法 将样品融化混匀,用乙腈沉淀蛋白,上层样液在4℃下冷冻离心后,取上清液用固相萃取OnGuardⅡ RP柱过滤后超滤离心,超滤液直接用离子色谱仪进行测定.采用IonPac(R) AS16型分析柱进行分离,用ASRS-ULTRAⅡ型阴离子抑制器、KOH淋洗液进行梯度洗脱,ED50型电导检测器进行检测,以外标法定量.结果 硫氰酸盐的标准曲线在0.10 mg/L～2.0 mg/L时呈现良好的线性关系,其线性方程为y=0.192x-0.015,相关系数r=0.999 2.该方法得到的硫氰酸盐的检出限为0.30 mg/kg,定量限为0.99 mg/kg,回收率为94.5％～ 103.6％,相对标准偏差RSD为1.4％～2.6％.结论 本方法样品前处理的净化效果好,准确可靠,适用于冰淇淋和雪糕中硫氰酸盐的检测.
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喉癌Hep-2细胞来源的exosomes 提取方法的比较
目的:对分离提取喉癌Hep-2细胞来源的exosomes 2种方法进行对比,展现不同方法的优缺点,为选择分离提取包括喉癌Hep-2细胞在内的肿瘤细胞来源exosomes的方法提供参考.方法:大量培养喉癌Hep-2细胞,42℃热休克处理.收集90 ml培养上清液,先通过3/0.8 μm深层过滤小型滤芯对上清液进行预处理,去除直径较大的颗粒和杂质,再利用蔗糖密度梯度离心联合超滤离心法,将上清液浓缩提纯;收集培养上清液4 ml,依次加入Exosome Isolation Kit内试剂,通过exosomes提取专用过滤柱,收集浓缩液.用高倍透射电子显微镜对2种方法所得的exosomes浓缩液分别鉴定,作出评价.结果:2种方法均能成功地从喉癌Hep-2细胞培养上清液中分离提取出exosomes.单个高倍视野下,蔗糖密度梯度离心联合超滤离心法提取exosomes分散性较好,但密度较低,背景见杂质较多;Exosome Isolation Kit所提取exosomes排列紧密,密度较高,背景杂质较少.结论:2种方法各具特点,均是较理想的exosomes分离提取方法.利用Exosome Isolation Kit分离提取exosomes具有样本量少、提取时间短、步骤简单、产物量大等优点,为喉癌Hep-2来源exosomes的分离提取提供了较好的选择.
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超滤离心法降低重组人脱细胞真皮基质牛血清白蛋白残留量检测中基质效应的实验研究
目的 探讨采用超滤离心法减少重组人脱细胞真皮基质(recombination human acellular dermal matrix,rhADM)样品浸提液对ELISA方法检测牛血清白蛋白(bovine semm albumin,BSA)残留量的基质效应.方法 清洗rhADM后,制备rhADM生理盐水浸提液.取超滤离心管若干,分别加入1 mg/mL BSA溶液(预饱和方式1,记作PR1)、10μg/mL BSA溶液(预饱和方式2,记作PR2)和rhADM浸提液2 mL(记作rhADM1和rhADM2),1 500×g离心20 min,重复操作3次后取出离心管内管,放入未使用的15 mL离心管中,在PRI和PR2管中加入10μg/mL BSA溶液4 mL,rhADM管中加入rhADM浸提液4 mL,同上法离心后,收集滤液.用ELISA法测定BSA含量.计算不同预饱和方式下10μg/mL BSA溶液的BSA回收率(以未经处理的10μg/mL BSA溶液作为基础样品,分别记作R10和R20);计算滤液稀释倍数的对数与测定吸光度(A)值的相关系数,并与未经超滤离心处理的浸提液检测结果进行比较.结果 采用预饱和方式1处理后,PRI1BSA浓度为(23.80±1.58)μg/mL,R10为(9.04±0.24)μg/mL,BSA回收率为263.4%±16.9%.采用预饱和方式2处理后,PR2 BSA浓度为(8.64±0.24)μg/mL,R20为(8.12±1.01)μg/mE,BSA的回收率为106.5%±3.O%.预饱和方式2的回收率符合检测要求.不同预饱和方式下BSA回收率差异有统计学意义(P＜0.01).经超滤离心处理后,滤液稀释倍数的对数与A值之间的相关性明显提高,相关系数由-0727提高至-0.960.超滤处理后的相关系数符合检测要求.结论 超滤离心处理可以有效减少rbADM样品浸提液的基质效应对BSA残留量检测的影响;样品浸提液自身对超滤离心管的预饱和处理,可得到较为理想的BSA回收率.
关键词： 牛血清白蛋白残留量 重组人脱细胞真皮基质 超滤离心 基质效应 -
喉癌 Hep -2细胞来源的 exosomes 的发现和鉴定
目的：观察喉癌 Hep -2细胞可否分泌 exosomes，并从形态学角度鉴定。方法：大量培养喉癌 Hep -2细胞，热休克处理，收集培养上清。先通过3/0.8μm 深层过滤小型滤芯对上清进行预处理，去除直径较大的颗粒和杂质。采用 Exosome Isolation Kit（商品化试剂盒）收集培养上清液4ml，依次加入 Exosome Isolation Kit内试剂，通过 exosomes 提取专用过滤柱，收集浓缩液。用高倍透射电子显微镜对 exosomes 做鉴定。结果：成功从喉癌 Hep -2细胞培养上清中分离提取出 exosomes，电镜观察见 exosomes 呈圆形或椭圆形双层膜的囊泡状结构，直径约20～100nm，密度较高，分散均匀。结论：首次发现喉癌细胞自身能分泌 exosomes，为喉癌免疫治疗做出新的探求。
