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自噬相关蛋白在自噬与凋亡中的作用及研究进展
上世纪中叶,随着电子显微镜的出现,两种与细胞命运息息相关的生理过程--自噬与凋亡被发现并命名,它们同时参与细胞损伤时的应激反应,并受到基因的严格调控.凋亡现象是多细胞生物面对生理或病理刺激时介导异常或不需要的细胞发生程序性死亡的过程,表现为细胞间连接消失、细胞体积缩小、胞质密度增加、线粒体通透性改变、核质浓缩、核膜核仁破碎、DNA降解、终分隔为几个凋亡小体被巨噬细胞所吞噬,整个过程以线粒体通透性改变、依赖半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)参与、凋亡小体形成为特征.
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维生素E琥珀酸酯诱导胃癌细胞凋亡
目的探讨维生素E琥珀酸酯(VES)诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡执行阶段的机制.方法分别将对照组0.1%无水乙醇和5,10,20 μg/ml VES加入培养液中,24 h后通过荧光染色观察细胞核形态和线粒体跨膜电位(ΔΨm)改变,并用Western蛋白印记检测凋亡诱导因子在线粒体和细胞质中的重新分布.结果 VES可明显诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡,20 μg/ml VES可使细胞凋亡率达到49.7%,伴有ΔΨm的明显降低,并有凋亡诱导因子自线粒体中的释放.结论 VES可能是通过使线粒体通透性改变,降低ΔΨm,并释放线粒体中的凋亡诱导因子,诱导SGC-7901细胞凋亡.
关键词： 维生素E琥珀酸酯(VES) 胃癌 线粒体通透性 凋亡诱导因子 -
环孢素预处理对大鼠心肌缺血-再灌注损伤的保护作用
目的:研究环孢素(CsA)预处理对大鼠心肌缺血-再灌注损伤的保护作用,并探讨其可能机制.方法:36只10周龄SD大鼠随机分为环孢素预处理(CsA)组、缺血-再灌注(IR)组、假手术(Sham)组,每组12只.应用Medlab生物信号采集处理系统连续监测各组左心室收缩末期压(LVESP)和心电图.再灌注结束后采集血液、心肌组织标本,检测血清肌酸激酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平及心肌组织半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性、心肌细胞线粒体通透性.结果:与IR组比较,CsA组大鼠再灌注性心律失常明显减少,抬高的ST段回落明显,LVESP保持稳定;血清CK-MB、LDH、TNF-α浓度明显降低;心肌组织Caspase-3活性显著降低;心肌细胞线粒体通透性减小.结论:CsA预处理能够减轻大鼠心肌缺血-再灌注损伤,其机制可能与CsA减小心肌细胞线粒体通透性,改善线粒体功能障碍;减少TNF-α的生成,减轻炎症反应和损伤;下调心肌组织Caspase-3表达,减少心肌细胞凋亡等有关.
关键词： 环孢素 心肌缺血-再灌注损伤 线粒体通透性 -
mtDNA与缺血缺氧性细胞损伤及疾病的关系
线粒体有相对独立的遗传系统和生物合成机构。线粒体与缺血缺氧性细胞损伤和疾病 密切相关。 1 线粒体DNA(mtDNA) 的结构特点 高等动物mtDNA是共价闭合的双链DNA,长度为16.5kb左右。mtDNA是核外遗传物质，按 线 粒体DNA物理结构将其分为编码区和非编码区。编码区共37个基因，编码22个tRNA，2个rRNA 和13条多肽； 非编码区即线粒体基因组的控制区也称为D-loop(控制区),占mtDNA的6%左右 。富含A-T碱基，遗传上属高变区。其碱基替换率比mtDNA其它区域高5-10倍，控制mtDNA的 复制和转录。 mtDNA特点：①全部转录，无内含子。② 双链编码，高度浓缩。③ 有多个拷贝，其拷 贝数存在器官组织的差异性。李晓东用定量Southern杂交法测定，发现大鼠骨骼肌的mtDNA 相对含量高，心脑及肝肾依次减少（P＜0.05），肝肾相对含量无明显差别。④ 一 个基因 执行多个功能。由于mtDNA是游离的，缺少蛋白保护，又处在一个高氧化还原环境中，所以m tDNA比nDNA （核DNA） 突变率高5-17倍，主要表现为缺如、插入和点突变 。其基因损伤是 导致氧化磷酸化中基因突变的主要部位。 2 缺血缺氧对线粒体酶含量及线粒体氧化磷酸化效率影响当缺血缺氧使参与线粒体氧化磷酸化的载体、酶损伤或底物缺乏时均会引起线粒体氧化磷酸 化功能损伤，从而导致细胞内能量代谢障碍。 失血性休克2 h NADH-CytC还原酶显著低于假处理组,3 h NADH-CoQ还原酶 、琥珀酸-CoQ 还原酶、细胞色素还原酶、细胞色素氧化酶均明显低于假处理组。细胞色素C、a、b、c1 在 休克时也明显减少，线粒体氧利用能力下降、线粒体内膜改变，细胞色素丢失；失血性休克 线粒体复合体Ⅰ+Ⅲ和复合体Ⅳ、复合体Ⅰ、复合体Ⅱ以及复合体Ⅱ+Ⅲ电子传递活性皆明显 下降。衰竭运动缺血缺氧也可引起心肌线粒体内膜流动性下降、NADH-CoQ还原酶和ATP酶活 性下降。 3 缺血缺氧有关mtDNA变化 Zullo报告慢性脑缺氧时脑组织中mtDNA4977片断缺失率升高,8羟基鸟嘌呤(8-hydroxy guan ine)下降,出现缺血缺氧核苷酸异常。 Sauleda J等报告慢性阻塞肺病患者（COPD）骨骼肌 细 胞色素氧化酶及其呼吸链电子传递终末复合体(COX)的活性增加似乎是通过增加线粒体Ribos ome的数量来调节于转录水平后引起的。曾昭惠等报告：实验性脑缺血小鼠脑线粒体DNA片段 缺失，12只中青年小鼠检出率为零，11只老年缺血鼠检出率为100%。富路等报告扩张性心肌 病17例中4例存在mtDNA7436缺失，一例肥厚性心肌病和一例心梗患者也检出了mtDNA 7436缺失。另外，还有mtDNA10423缺失。 袁祖贻等发现，慢性心力衰竭患者 活检心肌DNA4977缺失频率为100%，缺失率为0.103%-1.028%之间。mtDNA4977 、 mtDNA7436缺失将影响OXpHOS中5种复合酶中4种复合酶蛋白的编码（复合酶Ⅰ、Ⅲ、 Ⅳ、Ⅴ），OXpHOS受抑制。周林等证 明:自发性高血压大鼠心肌线粒体ATPase 6基因构象改变,8701位碱基由G变为A(G8701A),编 码 的第59位氨基酸由丙氨酸变成苏氨酸;(A8708G) ,编码的第61位氨基酸由组氨酸变成了精氨 酸。给HeLa细胞缺氧从135 mmHg降至15 mmHg，mRNA减少＞95%，在48 h内和Po2成线性 ，但是rRNAs不变。mRNA在复氧4-6 h后恢复。 4 线粒体DNA和核DNA的协作关系 哺乳动物mtDNA有不同于nDNA的复制和转录系统，但其复制、转录和翻译系统仍需nDNA 编码的多肽参与。此外，由核编码的存在于线粒体中的转录因子A（mtTFA）的转录可被核呼 吸因子NRF-1和 NRF-2活化，而这些呼吸因子也能调控核编码的COX 亚基和F1F0-ATP酶 亚基的表达，所以线粒体DNA和核DNA表达是协同的。 ROS可使哺乳动物细胞浆中转录因子NF-κB的无活性形式（由NF-κB二聚体和一个抑制亚基I κB组成）释放出有活性的NF-κB二聚体进入核内，与位于受NF-κB调控的基因上游增强子 结合， 使该基因转录增强。涉及的基因有引起炎症反应的基因、免疫细胞调节基因、分化基因等。 因此，ROS又被称为“逆向调节的第二信使”。另外，在理化及某些生物学因素的作用下， 线粒体膜可发生破碎、裂解，导致胞质中游离的mtDNA及mtDNA片段的形成，此时，当胞质 中DNA酶及DNA酶样物质的质和量受到影响时，游离的mtDNA 或mtDNA片段可随机整合到核基 因组中。 目前对细胞内缺氧反应基因（hypoxia responsive genes，HRG）和缺氧诱导因子-1（hy poxia inducible factor-1，HIF-1）有较深入的认识，认为缺氧可诱导HRG的转录增加 ，HIF-1对该过程有调控作用。 5 mtDNA与细胞凋亡、细胞程序化死亡的关系 细胞凋亡的特征是细胞由于降解酶 、水解酶 （蛋白酶、核酸酶）的作用，在近乎正常的细 胞质膜内程序化趋向死亡。线粒体与细胞凋亡密切相关。细胞凋亡早期线粒体跨膜电位（△ ψm）下降，线粒体△ψm 是线粒体电化学梯度（△μH+）主要构成部分，反映了线粒体 内 膜结构情况，有研究表明，线粒体通透性转运孔道（PTP）的生成，造成了线粒体内膜通透 性增加，导致△ψm下降甚至崩溃。PTP的作用有自放大效应，打开后可导致线粒体许多功能 产生致命性变化，从而启动了死亡途径 。细胞色素C与细胞凋亡的关系十分密切。 线粒体磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶(pHGPx)在防止细胞氧化损伤中起重要作用。 S aikumar证明缺血再灌流可造成电子传递损伤、线粒体通透性改变。CytC释放、氧应激可造 成细胞程序化死亡，这是众多疾病的重要原因。 6 mtDNA多态性 过去20年左右时间里，一直认为线粒体DNA是纯母系遗传，表现为非孟德尔规律遗传。现已 认为，父亲的遗传物质对子代的mtDNA碱基组成同样存在影响，是形成mtDNA，产生个体特异 性的一个机制。目前多用PCR-RFLP来分析DNA多态性。对人mtDNA D环一端347bp的序列分析 资料证明，2个无关个体间，这一段mtDNA序列完全相同的可能性只有0.27%（即1/370）。 7 缺血缺氧性mtDNA疾病研究发展趋势 对线粒体疾病的分子遗传机理的研究可以进一步阐明这些疾病的病因，线粒体基因组的表达 调节，核基因组与线粒体基因组的相互作用及两个基因组间协调一致表达的机理，并为治疗 提供理论指导。已建立了人类无mtDNA细胞系，即rh0(po)细胞，转线粒体细胞系。它们 在调 查线粒体DNA突变的分子生物学机理，分析核背景在突变表型中的作用，研究突变型与野生 型线粒体DNA间的互补及分离行为中发挥重要作用。利用DNA蕊片技术可利用基因表达谱测定 突变，进行多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。但还未见有将之运用于mtDNA研究 的相关文献。 机体缺血缺氧严重时，细胞内氧分压也会迅速降低，通过生化改变、自由基介导和钙反常等 引起细胞凋亡或坏死。目前，有人设想应用DNA蕊片技术筛选对线粒体相关蛋白起调控作用 的核因子(如NRF），再将筛选的核因子进行转染，从而对线粒体缺氧相关蛋白进行调控，改 善氧利用。如能对这种核转录因子的活化进行调控，则对改善细胞线粒体功能和氧利用，保 护和减少细胞损伤，防治严重创伤早期全身缺血缺氧损害的综合症，防止和降低休克的发生 率和死亡率，无疑具有极重要意义。
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雷公藤红素对体外人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡的影响及机制研究
目的:研究雷公藤红素对体外人肝癌HepG2细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其作用机制.方法:采用CCK-8法测定2、5、10μmol/L雷公藤红素分别作用24、48、72 h后的细胞活性,并计算增殖抑制率和半数抑制浓度(IC50);采用流式细胞术检测2、5、10μmol/L雷公藤红素分别作用24 h后细胞的凋亡率及周期变化,并以二甲基亚砜(DMSO)为阴性对照;采用罗丹明123染色法测定2、5、10μmol/L雷公藤红素分别作用48 h后的细胞线粒体膜电位,并以DMSO为阴性对照;采用Western blot法检测5μmol/L雷公藤红素作用0、12、24、36 h后细胞中促凋亡相关基因Bax和B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)的蛋白表达.结果:2、5、10μmol/L雷公藤红素均可抑制细胞的增殖,IC50为5.834μmol/L.2、5、10μmol/L雷公藤红素均可诱导细胞凋亡.5、10μmol/L雷公藤红素可阻滞细胞于G0/G1、S期,并可降低线粒体膜电位,较阴性对照差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01),且以上作用均具有浓度依赖性.5μmol/L雷公藤红素作用12、24、36 h后可上调细胞中Bax蛋白表达、下调Bcl-2蛋白表达,并呈现一定的时间依赖性,较0 h时差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01).结论:雷公藤红素可明显抑制体外人肝癌HepG2细胞的增殖并诱导其凋亡,其机制可能与增强线粒体通透性、促使凋亡诱导因子释放有关.
