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小干扰 RNA 沉默人乳头瘤病毒16E6基因对子宫颈癌 SiHa 细胞系中 E-钙黏蛋白表达及高甲基化的影响
目的：研究小干扰 RNA（siRNA）沉默人乳头瘤病毒（HPV）16E6基因对子宫颈癌 SiHa细胞系中 E-钙黏蛋白（E-cad）表达及其基因启动子区高甲基化的影响。方法运用以慢病毒为载体质粒的 siRNA 沉默子宫颈癌 SiHa 细胞系中 HPV16E6基因。采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）法及蛋白质印迹法（Western blot）分别检测沉默后 SiHa 细胞中 HPV16E6 mRNA 表达水平、E-cad mRNA及蛋白表达水平。用甲基化特异性 PCR（MSP）法检测 SiHa 细胞系中 E-cad 基因（CDH1）启动子区甲基化情况。结果 siRNA E6组、空载体组、空白对照组 E-cad mRNA 相对表达量分别为4.755±1.085、1.224±0.840、1.327±1.221，蛋白相对表达量分别为0.616±0.019、0.325±0.016、0.299±0.015，其中siRNA E6组 SiHa 细胞中 E-cad mRNA 及蛋白相对表达量明显高于另两组，差异均有统计学意义（F＝21.346，P＜0.01；F＝323.398，P＜0.01），而空载体组和空白对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。与HPV16E6基因沉默前 E-cad 完全甲基化状态相比较，沉默后 E-cad 基因甲基化扩增产物呈弱阳性，其强度较空载体组及空白对照组明显减弱，而非甲基化扩增呈阳性。结论 HPV16E6基因沉默可使子宫颈癌SiHa 细胞中 E-cad 表达上调，同时能够降低 CDH1基因启动子区高甲基化水平，可能在一定程度上扭转CDH1基因启动子区的高甲基化状态，引起 E-cad 重新表达。
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小片段干扰 RNA 抑制人肝癌细胞株中YAP 基因表达的研究
目的：研究用小片段干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）抑制肝癌细胞株中 YAP（yes-associated protein）表达后肝癌细胞株对阿霉素（adriamycin，ADM）的敏感性变化。方法：设计 YAP 基因的 siRNA 序列，用脂质体 LipofectamineTM 2000将 siRNA 转染至4株肝癌细胞株 PLC／PRF／5、Huh-7、MHCC 97H、MHCC 97L 中，在荧光显微镜下观察并采用蛋白免疫印迹（Western blotting）法检测肝癌细胞株中 YAP 的表达。将细胞以不同浓度的 ADM 处理后，采用四甲基偶氮唑蓝（methyl thialzolyl tetrazolium，MTT）比色法检测细胞的存活率。结果：成功构建针对 YAP 的 siRNA 表达载体。Western blotting 结果显示，肝癌细胞株经特异性 siRNA 转染后，YAP 蛋白的表达受到抑制，表明 RNA 干扰（RNA interference， RNAi）能特异、有效地抑制肝癌细胞株中 YAP 的表达。MTT 结果显示，转染 YAP siRNA 后肝癌细胞株的存活率受到明显抑制。结论：siRNA 抑制肝癌细胞株中 YAP 的表达可增强肝癌细胞株对 ADM 的敏感性。
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脊髓脂质运载蛋白-2对大鼠吗啡耐受形成的影响
目的：探索用 RNA 干扰（RNAi）法沉默脊髓脂质运载蛋白-2（lipocalin-2，LCN2）的表达及其对正常大鼠吗啡耐受形成的影响。方法鞘内置管成功的♂SD 大鼠48只，体质量180～220 g，随机均分为4组，每组12只：Ⅰ组对照组、Ⅱ组吗啡耐受组、Ⅲ组错义小干扰 RNA（mismatch siRNA，MM siRNA）组、Ⅳ组 LCN2小干扰 RNA（LCN2 siRNA）组。所有大鼠鞘内置管术后 d 6确定导管位置，记为 d 0。d 2～8连续7 d，每天2次进行皮下注射，每次注射剂量10μg·g －1，Ⅰ组大鼠皮下注射生理盐水（normal saline，NS），Ⅱ－Ⅳ组大鼠皮下注射吗啡建立吗啡耐受模型。各组大鼠每天皮下给药前分别鞘内注射10μL DEPC 溶液、10μL DEPC 溶液、10μL 含4μg MM siRNA 的 DEPC 溶液和10μL 含4μg LCN2 siRNA 的 DEPC 溶液。d 1、d 9，测定所有大鼠的基础热缩足反应潜伏期（paw withdrawal thermal latency，PWTL）及皮下注射吗啡后45 min 的 PWTL，并计算吗啡的大可能镇痛效应百分比值（％ maximal possible effect，％MPE）。d 9行为学测试结束后，取脊髓腰膨大，用 Western blot 法检测磷酸化 p38丝裂原活化蛋白激酶（p-p38 MAPK）及 LCN2蛋白表达水平，用免疫组织荧光染色法检测小胶质细胞标记物Iba1的表达。结果d 9，与Ⅰ组比，Ⅱ、Ⅲ组大鼠％MPE 值明显下降（P ＜0.05），腰段脊髓 LCN2、p-p38 MAPK、Iba1表达明显增加（P ＜0.05）。与Ⅱ组比，Ⅳ组大鼠的％MPE 值明显增加（P ＜0.05），脊髓 LCN2、p-p38MAPK、Iba1表达明显下降（P ＜0.05）。结论鞘内注射 LCN2 siRNA 沉默脊髓LCN2的表达能够部分抑制吗啡耐受的形成，该现象可能与其抑制脊髓背角小胶质细胞的活化及脊髓 p-p38 MAPK 的表达有关。
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靶向 survivin 基因的小干扰 RNA 对食管癌细胞Eca －109化疗敏感性的影响
目的：利用 RNAi （RNA interference， RNAi）技术抑制食管癌 Eca －109细胞 survivin 基因表达，观察 survivin 基因沉默后对 Eca －109细胞化疗敏感性的影响。方法构建靶向 survivin 基因特定序列的小干扰 RNA（small interference RNA， siRNA）真核表达载体并转染 Eca －109细胞，筛选得到稳定转染的 survivin 干扰组细胞 Eca －109／si －survivin，同时设转染无关干扰质粒的 Eca －109细胞为阴性对照组，未转染的 Eca －109细胞为空白对照组；通过 Western Blot 法检测干扰前后 survivin 基因沉默抑制效果；随后将各组细胞与不同浓度的氟尿嘧啶（5－Fu）作用，MTT 法检测各组细胞对5－Fu 的半数抑制浓度（IC50），流式细胞仪分析各组细胞的凋亡率。结果干扰组 Eca －109／si －survivin 细胞 survivin 蛋白表达水平（18．75±3．12）较阴性对照组 Eca －109／si －control（44．17±3．15）及空白对照组 Eca －109（46．20±2．62）明显下调（P ＜0．05）；联合应用5－Fu 的Eca －109／si －survivin 干扰组细胞 IC50为（18．75±1．53）mg? L－1，显著低于空白对照组（39．65±1．75）mg? L－1和阴性对照组（38．95±1．34）mg? L－1，差异具有统计学意义（P ＜0．05）；联合应用5－Fu 的 Eca －109／si －survivin 干扰组细胞凋亡率为（37．35±1．52）％，明显高于空白对照组（11．26±1．21）％和阴性对照组（12．34±1．32）％，差异具有显著性（P ＜0．05）。结论靶向 survivin 的 siRNA 能特异性沉默 survivin 基因表达，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，并增强人食管癌 Eca －109细胞对5－Fu 的化疗敏感性。
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Livin 基因 siRNA 重组表达载体的构建
目的：构建针对人抑凋亡基因 Livin 的小干扰 RNA(siRNA)重组表达质粒载体。方法通过分子克隆技术,设计并合成具有基因特异性的3组寡核苷酸片段,克隆到 pmU6质粒载体,并经菌落 PCR 鉴定及测序鉴定,Livin 的 siRNA 序列成功克隆到重组表达质粒载体中。结果经菌落 PCR 鉴定及测序鉴定证实,人 Livin 的 siRNA 序列成功克隆到表达载体中,插入序列正确。结论成功构建了 Livin siRNA 质粒表达载体,为后续研究降低或沉默 Livin 基因表达后能否有效抑制膀胱癌细胞增殖和促进细胞凋亡奠定了基础。
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HIF-1α特异性RNA干扰表达载体的构建及体外效应研究
目的 己知缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在缺氧状态下可通过调节内皮素-1(ET-1)的升高而参与肺血管内皮细胞损伤及肺动脉高压,终导致肺出血.RNA干扰(RNAi)是双链RNA介导的序列特异性转录后同源靶基因沉默效应,目前RNAi技术已成为一种研究基因功能的有力工具,故拟通过构建人HIF-1α基因的特异性小干扰RNA(siRNA)真核表达载体,观测该载体在缺氧状态下对HIF-1α基因的干扰作用及对ET-1的抑制作用.方法 选择6个(a-f)可能的人HIF-1α siRNA干扰位点,设计合成相应的特异性互补寡聚核苷酸链(A～F),采用基因克隆技术,将合成的(A～F)链序列定向插入真核表达载体中,构建成重组质粒HIF-1α siRNA真核表达载体(A'～F'),通过脂质体法转染至体外人脐静脉内皮细胞(HUVECs)48 h,再以CoCl2(100μM)模拟缺氧刺激3 h后,观测siRNA对HIF-1αmRNA和HIF-1α蛋白表达的抑制效应及ET-1水平.结果 ①成功构建了分别针对6个HIF-1αsiRNA干扰位点(a～f)的重组质粒HIF-1α siRNA真核表达载体(A'-F');②该6组真核表达载体转染HUVECs并经CoCl2模拟缺氧刺激后,与未转染组比较,结果 显示B'及D'组明显抑制HIF-1α mRNA及HIF-1α蛋白的表达,并部分抑制ET-1表达,而其余4组与未转染组比较并无差异.结论 针对b及d干扰位点的B'及D'特异性siRNA真核表达载体,能明显干扰HIF-1α基因的表达,进而抑制ET-1的释放.该实验为下一步用B'、D'特异性siRNA真核表达载体在动物体内研究HIF-1α与新生儿缺氧性肺出血关系奠定基础.
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利用纳米和RNA干扰技术抑制HBV-DNA在HepG2 2.2.15细胞中的复制和表达
目的:通过RNA干扰和纳米技术抑制HBV-DNA在体外的复制和HBV核心抗原的表达.方法:制备靶向HBV核心抗原(HBcAg)的纳米小干扰RNA(siRNA),利用U6启动子质粒转染入HepG2 2.2.15细胞;RT-PCR和Western印迹检测转染细胞HBV核心抗原在mRNA和蛋白水平的表达情况;real-time PCR 检测上清液HBV-DNA,放射免疫法检测细胞HBV表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)、核心抗原(HBcAg).结果:成功构建了含磁性纳米的siRNA质粒;多种方法检测均显示转染后的细胞HBV核心抗原表达明显下降;其表面抗原、e抗原和HBV-DNA值均较对照组降低.结论:RNA干扰联合纳米技术可明显下调HBV核心抗原的表达,抑制HBV-DNA复制.
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siRNA逆转乳腺癌细胞系MCF-7/ADR耐药
背景与目的:肿瘤的多药耐药性常导致乳腺癌化疗失败,多药耐药基因 1( multidrug resistance 1,mdr1)编码的 P 糖蛋白 (P-glycoprotein,P-gp)过度表达是重要的耐药机制.本研究拟探讨 siRNA抑制耐药乳腺癌细胞系 MCF-7/ADR mdr1基因表达的可行性.方法:选择耐阿霉素人乳腺癌细胞系 MCF-7/ADR及其敏感细胞系 MCF-7作为研究对象.将预先设计的 siRNA包装入质粒载体,然后转化质粒到大肠杆菌中,经过克隆、扩增、纯化后转染到 MCF-7/ADR细胞中,潮霉素筛选,流式细胞仪检测 P-gp的表达率,实时定量 PCR检测 mdr1基因的表达率,并对转染后的细胞作阿霉素耐药实验.结果:流式细胞仪检测结果显示, MCF-7/ADR细胞经特异性 siRNA作用后, P-gp的表达率由 99 8%下降到 12 3%.实时相对定量 PCR检测结果显示, MCF-7/ADR细胞经特异性 siRNA作用后其 Ct值由 25 22增加到 30 64.阿霉素耐药实验显示,转染 siRNA 的 MCF-7/ADR细胞 IC50为 0 51 μ mol/L,而未转染组的 IC50为 17 88 μ mol/L.结论: siRNA能引发人乳腺癌多耐药细胞系 MCF-7/ADR内 mdr1基因沉默,从而为 siRNA作为一种可能的治疗手段提供了理论依据.
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沉默 ATM基因对人胃癌细胞 BGC823放射敏感性的影响
目的：探讨毛细血管扩张突变基因（ATM）对人胃癌细胞放射敏感性的影响。方法：将 ATM基因敲减后获取得到的稳定转染克隆细胞和空载细胞同时通过不同剂量的照射后，观察敲减 ATM基因前后 BGC823细胞平板克隆形成率，并使用流式细胞术，观察 ATM被敲减后对细胞周期和凋亡的影响。结果：BGC823细胞中的 ATM被敲减后，经不同剂量的照射（2、4、6和8Gy）克隆形成率分别为（15．4±0．9）％、（9．2±0．3）％、（2．2±0．1）％和（1．0±0．1）％，远低于空载细胞的克隆形成率分别为（28．1±0．6）％、（15．6±0．8）％、（5．3±0．1）％和（1．8±0．1）％，P 均小于0．05，有显著性差异。采用相同剂量（4Gy）照射后，流式细胞术检测发现，BGC823细胞中的 ATM被敲减后，细胞周期被阻滞，细胞停止生长，并在12h 后出现凋亡的现象。结论：ATM基因的表达可影响胃癌细胞的放射敏感性，ATM的表达被敲减后对 BGC823细胞的放射起到增敏作用。ATM基因在胃癌放射敏感性方面可能有非常重要的作用。
关键词： 胃癌 毛细血管扩张突变基因 小干扰 RNA 放射敏感性 -
LncRNA －MALAT1在缺氧诱导胃癌侵袭转移中的作用
目的：探讨 LncRNA －MALAT1对缺氧诱导胃癌侵袭转移的影响。方法：RT －PCR 检测胃癌组织标本和胃癌细胞株中 MALAT1的表达；通过基因重组方法构建 MALAT1的 siRNA 载体，并感染人 SGC7901及MKN45胃癌细胞，RT －PCR 验证 siRNA 干扰有效；Transwell 实验研究其对胃癌细胞 SGC7901及 MKN45侵袭转移能力的影响。结果：MALAT1在胃癌组织和胃癌细胞株中的表达高于癌旁组织和胃正常上皮细胞；缺氧能够促进 SGC7901及 MKN45细胞的侵袭转移能力，而下调 MALAT1能够明显抑制缺氧条件下 SGC7901及MKN45细胞的侵袭转移能力。结论：MALAT1在促进胃癌细胞的侵袭转移中发挥重要作用，为胃癌靶向治疗提供理论依据。
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靶向 VEGF 基因的 siRNA 体外抑制兔 VX2细胞生长的研究
目的：探讨靶向 VEGF 基因的 siRNA 对兔 VX2肿瘤细胞生长的影响。方法：采用化学合成法得到靶向兔 VX2细胞 VEGF 基因的 siRNA 分子，应用脂质体将其转染体外培养的 VX2细胞。转染48h 后，RT - PCR法检测 VEGF mRNA 水平，ELISA 法检测细胞分泌的 VEGF 蛋白，MTT 法检测细胞生长活力。结果：VEGF -si1和 VEGF - si3单独转染 VX2细胞，细胞的生长抑制率分别为（38.5±7.3）％和（30.0±5.8）％，均显著高于 scr - siRNA 转染的对照组（P ＜0.01）；细胞 VEGF mRNA 表达水平分别为（0.37±0.06）和（0.45±0.07），均显著低于对照组（P ＜0.01）；细胞分泌 VEGF 蛋白的抑制率分别为（58.1±7.3）％和（51.9±7.9）％，均显著高于对照组（P ＜0.01）。结论：VEGF siRNA 分子在体外能特异地抑制兔 VX2细胞的 VEGF 基因 mRNA 转录，VEGF 蛋白分泌以及细胞增殖。
关键词： 小干扰 RNA 血管内皮细胞生长因子 VX2 细胞 转染
