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人Egr-1启动子调控的自杀基因真核表达载体的构建及其在鼻咽癌细胞株中的放射诱导表达
[目的] 构建由人Egr-1放射诱导性启动子调控的自杀基因靶向性真核表达载体,并转染人鼻咽癌细胞株CNE,比较射线诱导前后自杀基因在鼻咽癌细胞中的表达情况.[方法] 根据Genebank数据库提供的人Egr-1启动子基因序列,设计一对引物克隆人Egr-1启动子,采用PCR、酶切、连接等分子生物学技术,构建pcDNA3.1(+)-Egr-1-CD重组质粒表达载体,并利用脂质体转染方法转染人CNE细胞株,经G418筛选后获得阳性细胞克隆.RT-PCR分析鉴定0、5、10、15、20Gy放射剂量进行6MV X线照射对CD基因表达的影响.[结果] 经PCR、酶切、测序等证实了pcDNA3.1(+)-Egr-1-CD重组靶向性质粒表达载体构建成功,G418筛选所得到的CNE细胞阳性克隆经不同放射剂量的诱导后,RT-PCR结果显示体外放射线照射可显著提高CNE细胞中CDmRNA的表达水平,在10Gy及15Gy组CDmRNA的表达水平明显增高.尤以15Gy组CDmRNA的表达水平高,在20Gy组CDmRNA的表达水平反而下降.[结论] pcDNA3.1(+)-Egr-1-CD重组质粒表达载体构建成功,并成功转染人鼻咽癌细胞株,建立了基因表达与放射的剂量效应关系,为后续的临床应用研究奠定基础.
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融合自杀基因对鼻咽癌细胞的体内杀伤作用
[目的]研究融合自杀基因对鼻咽癌细胞的体内杀伤作用.[方法]培养鼻咽癌CNE-2细胞,建立裸鼠荷瘤模型.随机分为6组,每组5只,A组:脂质体包裹质粒瘤内注射瘤内组;B组:脂质体包裹质粒瘤内注射+肿瘤局部照射γ射线(总剂量9Gy)组；C组:脂质体包裹质粒瘤内注射+腹腔注射5氟胞嘧啶(5-Fc)组；D组:脂质体包裹质粒瘤内注射+肿瘤局部照射γ射线(总剂量9Gy)+腹腔注射5-Fc组；E组:肿瘤局部照射γ射线(总剂量9Gy)+腹腔注射5-Fc,以及空白对照组.记录肿瘤体积变化；计算各组肿瘤抑制率,绘制肿瘤生长曲线;取肿瘤组织进行病理观察；鉴定肿瘤组织中CD/UPRT.UL49基因.肿瘤体积变化的比较采用单向方差分析,组间多重比较采用LSD法.[结果]成功建立鼻咽癌裸鼠荷瘤模型,生长曲线显示:5组瘤体积差异有统计学意义(F=720.684,P＜0.01),测序结果证实,除E组外,其余各处理组均检测到目的基因,且Western blot检测结果示:B和D组肿瘤组织内自杀基因的表达高于其余各组.病理切片证实肿块为低分化鳞癌,其中D组肿瘤组织在干预作用下出现明显坏死.[结论] E6.BARF1p.CD/UPRT.UL49自杀基因载体联合前药5-Fc在放射线的作用下,可明显抑制鼻咽癌移植瘤的生长,转染该融合自杀基因可增强放疗敏感性,为鼻咽癌的基因—放射治疗开辟了新思路.
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卵巢上皮癌自杀基因疗法研究进展
近年来卵巢上皮癌的自杀基因疗法取得很大进展,主要体现在:由组织特异性启动子参与调控,增强基因转染的靶向性,降低对非肿瘤组织的副作用;自杀基因(如HSV-TK基因)与免疫增强基因的联合应用;自杀基因与放射治疗的联合应用;增强自杀基因表达效率的辅助方法.
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自杀基因在肺癌中的研究进展
全文从自杀基因治疗体系的构成、作用机制、旁观者效应、与其他治疗联合应用、提高自杀基因转导效率及其在肺癌中的研究进展进行综述.
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肝细胞癌的基因免疫治疗
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是导致癌性死亡的第三大原因,每年有100万新病例.目前更多的治疗手段是外科、移植、放疗或化疗及基因等综合治疗,其中基因免疫治疗被认为是有前途的研究方向之一.现仅就肝细胞癌近的治疗热点基因免疫治疗作一综述.
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丹参注射液对自杀基因tk/GCV系统的协同增效作用
目的探讨丹参注射液联合自杀基因系统对大鼠肝癌细胞和小鼠移植瘤的作用.方法①丹参注射液以不同浓度与GCV分别或共同作用于大鼠肝癌CBRH7919的tk-细胞,以及含5%tk+的tk+、tk-混合细胞,MTT法检测各组存活率,用Q值(实测药效与理论药效的比值)分析中药与自杀基因系统联合的相互作用是否有协同性,0.85≤Q<1.15为相加;Q≥1.15为协同.②把小鼠肝癌细胞H22/tk(tk+)与H22(tk-)细胞按1:4混合,再按2×106细胞/只接种到Balb/c纯系小鼠腋下皮下组织内,随机分为模型组、丹参(注射液)组、tk/GCV组、tk/GCV联合丹参注射液治疗的联合组,n=9～11;中药治疗从d 2起共15 d,自杀基因系统治疗从长出肿瘤后开始共10 d,进行疗效观察.结果①各组存活率tk/GCV组为63.10%±2.17%,GCV组为67.03%±2.81%,5 ml·L-1丹参联合tk/GCV组为26.67%±4.23%(Q=1.22),5 ml·L-1丹参+GCV组为42.17%±5.36%(Q=1.04);10 ml·L-1丹参联合tk/GCV组为18.10%±5.56%(Q=1.26),10 ml·L-1丹参+GCV组为33.84%±9.84%(Q=1.06).②接种后各组均在d 7触摸到肿瘤,成瘤率100%.联合组在治疗后肿瘤生长呈现明显抑制,终肿瘤体积(1.53±0.88) cm3,比模型组(3.19±1.76) cm3减少52.01%(P<0.05);肿瘤质量(1.32±0.80) g,比模型组(2.28±1.20) g减少42.11% (P<0.05),差异有统计学意义.丹参组、tk/GCV组肿瘤体积、瘤块质量与模型组比较差异均无统计学意义.结论丹参注射液能提高自杀基因系统对大鼠肝癌细胞的杀伤力和对小鼠肝癌细胞移植瘤的抑制作用,两者联合作用的协同性提示丹参注射液能增强自杀基因旁观者效应.
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逆转录病毒介导的双自杀基因对淋巴瘤细胞的杀伤作用研究
目的观察逆转录病毒介导的双自杀基因对淋巴瘤细胞的杀伤作用,探讨淋巴瘤的基因治疗方法.方法在脂质体的介导下将含有双自杀基因的逆转录病毒载体pWZLneoCDglytk导入包装细胞PA317,经G418筛选后大量培养产病毒的阳性克隆PA317/CD+tk细胞株,收集病毒上清,浓缩后转染Raji淋巴瘤细胞,再次经G418筛选,获得稳定表达双自杀基因的Raji/CD+tk细胞株.采用RT-PCR法检测双自杀基因的表达.MTT法测定转基因组及未转基因组Raji细胞的存活率.结果双自杀基因在Raji细胞中可稳定表达,联合使用5-氟胞嘧啶(5-FC)和无环鸟苷(GCV)对细胞增殖的杀伤作用及旁杀伤效应高于单独使用5-FC或GCV.结论逆转录病毒介导双自杀基因较单一自杀基因具有更强的杀伤作用.
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含胞嘧啶脱氨酶基因的靶向腺病毒载体的构建及应用
目的建立癌胚抗原(CEA)启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶基因(CD)自杀基因的腺病毒载体AdCEACD,使CD基因只能在CEA阳性的细胞中表达.方法采用同源重组法在人胚肾细胞株293细胞中重组腺病毒,用点杂交、PCR法进行鉴定,并进行纯化和滴度测定,分别感染CEA阳性和CEA阴性的细胞,采用MTT法检测感染细胞对5-Fc的敏感性.结果重组腺病毒中含有CEA基因及CD基因,纯化后滴度可以达到5.0×1011pfu/ml,CEA阴性的Hela细胞感染AdCMVCD后对5-Fc很敏感,而感染AdCEACD后不能被5-Fc杀伤,与之相反,CEA阳性的Lovo细胞感染AdCMVCD和AdCEACD后有相似的表达活性,均对5-Fc敏感.AdCEACD/5-Fc系统有明显的"旁观者"效应.结论本实验建立的CEA启动子驱动的含CD自杀基因的腺病毒载体AdCEACD,能使CD基因专一性地在CEA阳性细胞中表达,有助于对CEA阳性的肿瘤细胞靶向性自杀基因治疗.
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自杀基因疗法联合化疗对癌胚抗原表达型肺肿瘤的杀伤作用
目的探讨阳离子脂质体介导E.coli cd/HSV-1 tk融合自杀基因联合长春瑞滨对癌胚抗原阳性肺癌的体内杀伤作用.方法裸鼠皮下接种肺癌细胞SPCA-1后第5、9、13天,腹腔注射阳离子脂质体/pE-CEAcd-tk复合物,于第6～15天连续腹腔注射5-氟胞嘧碇+丙氧鸟苷前体药物进行自杀基因治疗.于第5、13天给予长春瑞滨进行联合治疗.结果阳离子脂质体介导融合自杀基因联合长春瑞滨使小鼠皮下的肿瘤结节的生长受到显著抑制.其平均瘤体体积显著小于单独自杀基因或化疗治疗组的平均瘤体体积(P＜0.01).结论阳离子脂质体介导E.coli cd/HSV-1 tk融合基因联合长春瑞滨化疗在体内可有效抑制肺肿瘤的生长,为癌胚抗原阳性肺癌的治疗提供了1条新的途径.
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AdCMVCD/5FC自杀基因系统治疗CABG术后再狭窄
目的研究胞嘧啶脱氨酶基因/5-氟胞嘧啶自杀基因系统对冠状动脉旁路移植术后再狭窄的治疗作用.方法将含AdCMVCD的病毒上清加压注人兔颈外静脉管腔,半小时后剪下该静脉并用Cuff技术移植于兔颈动脉上,以单纯移植组和AdCMVLacz为对照,通过光镜和电镜观察平滑肌细胞的形态变化,并对血管桥外径、管腔、内膜、中膜面积和外弹力膜周长及管腔相对丧失率进行定量分析,以观察抑制内膜和中膜增生、防止血管再狭窄的效果. 结果治疗组的内膜和中膜面积明显小于两个对照组;管腔丧失率亦明显减少,AdCMVCD组为3.68±0.42%,单纯移植组为9.68±0.41%,P＜0.01.结论AdCMVCD自杀基因系统对冠状动脉旁路移植术后再狭窄有明显的治疗作用.
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胰腺癌自杀基因治疗的研究进展
目前消化系肿瘤的治疗主要是手术治疗结合化疗或放疗,但辅助治疗如对胰腺癌的化疗效果不理想.自杀基因治疗可以增强胰腺癌化疗疗效、减轻化疗的毒副作用.本文对胰腺癌自杀基因治疗的研究进展作一综述.1 自杀基因的基本概念自杀基因(suicide gene)又称化疗敏感基因(chemosensitive gene)、化疗药物前体活化基因(prodrug activation gene),是存在于细菌或真菌中的一类基因,哺乳动物体内往往缺乏.自杀基因通过编码特异的酶,将一些低毒或无毒的前体化疗药物转化为具有毒性的代谢产物而发挥抗肿瘤作用.
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新型自杀基因亚麻苦甙水解酶/亚麻苦甙系统的研究应用
亚麻苦甙水解酶/亚麻苦甙(lis/lin)系统作为一种新型自杀基因系统,为肿瘤的基因治疗提供了又一手段.研究表明,它通过水解前体药物产生氰根离子(CN-)对靶细胞产生杀伤效应.相比较其他自杀基因系统,lis/lin自杀基因系统具有高效、无不良反应等特点,同时其旁观者效应机制也不同于其他自杀基因系统,表现出更为强大杀伤周围靶细胞的作用.因此,作为一种新型的自杀基因系统,将有希望用于肿瘤临床治疗.
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自杀基因在异基因骨髓移植中的应用
异基因骨髓移植(allo-BMT)是治愈恶性血液系统疾病的重要方法之一,但其并发症移植物抗宿主病(GVHD)限制了其在临床上的发展应用.国内外不少研究表明自杀基因转染T淋巴细胞可控制移植物抗宿主病.
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乳腺癌的自杀基因治疗研究进展
从自杀基因治疗乳腺癌的研究现状、自杀基因体系、旁观者效应、临床试验研究等方面综述了近几年自杀基因治疗乳腺癌的实验和临床研究的进展。
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腺相关病毒载体及其介导的自杀基因疗法
自杀基因疗法是肿瘤治疗的方法之一.腺相关病毒(AAV)载体介导的自杀基因疗法尤其备受关注.通过对AAV栽体的选择改建,调控外源基因的有效表达,提高基因转染的效率,充分发挥自杀基因的杀伤作用及旁观者效应来达到治疗肿瘤的目的.本文就AAV栽体及其介导的自杀基因疗法方面的进展作一综述.
关键词： 腺相关病毒(AAV)载体 自杀基因 旁观者效应 -
胆管癌基因治疗研究进展
胆管癌的基因治疗研究日益受到人们的重视,并且目前亦取得了一定的进展.本文从抑癌基因治疗、自杀基因治疗、反义基因治疗等几个方面对胆管癌基因治疗研究进展作一简要综述.
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黑素瘤MIA启动子介导的CD/TK双自杀基因重组腺病毒系统选择性杀伤黑素瘤细胞
目的:探讨黑素瘤抑制蛋白(melanoma inhibitory activity,MIA)启动子介导的CD/TK双自杀基因重组腺病毒系统,对黑素瘤细胞A375的选择性杀伤作用.方法:构建腺病毒穿梭质粒pAdrMIA-CD/TK,在293细胞内包装、扩增、纯化后,体外转染人表皮黑素细胞HeMa-LP、黑素瘤细胞A375和人宫颈癌细胞HeLa,RT-PCR检测基因CD和TK片段,加入前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或丙氧鸟苷(GCV),用MTT法测定该体系对细胞株的杀伤效应.结果:制备的病毒滴度为1×1011 pfu/L,用100m.o.i.重组腺病毒感染细胞后,发现目的基因CD和TK片段可在黑素瘤细胞中表达,转染目的基因的黑素瘤细胞A375对5-FC和GCV具有一定的敏感性,细胞存活率较对照组显著下降(P＜0.05),联合应用两种药物对A375细胞的杀伤作用较单用一种显著增强(P＜0.05).对人表皮黑素细胞HEMa-LP和人宫颈癌细胞HeLa无显著杀伤作用.结论:构建的黑素瘤MIA启动子介导的CD/TK双自杀基因重组腺病毒系统,在体外可选择性杀伤黑素瘤细胞A375.
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外源基因治疗肿瘤研究进展
肿瘤的发生和发展涉及单个或多个基因的改变.肿瘤的基因治疗已成为新的发展方向.外源基因治疗肿瘤的研究集中在以下3个方面:1)通过转入自杀基因引起肿瘤细胞表型的改变,从而引起药物对肿瘤细胞直接或间接杀伤作用;2)通过转入外源的小分子RNA干扰沉默肿瘤细胞中突变基因的表达;3)通过外源基因的引入增强药物化疗效果.本文就这3个方面的治疗机制及研究现状进行阐述.
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MDR1启动子调控的双自杀基因真核表达载体的构建及其在K562/A02细胞中的表达
目的:构建多药耐药基因(MDR1)启动子调控的CD-TK双自杀基因真核表达载体用于耐药白血病的靶向性基因治疗.方法:采用PCR方法从K562/A02细胞基因组DNA中扩增MDR1启动子,将其连接到双自杀基因CD-TK的上游,构建pcDNA3-MDR1-Promoter-CD-TK真核表达载体,用脂质体介导法将构建好的载体转染入K562、K562/A02细胞,PCR鉴定CD、TK基因的整合,RT-PCR鉴定CD、TK基因的表达.结果:PCR克隆出MDR1启动子经DNA测序证实序列正确,通过连接成功构建含正确目的基因的表达载体pcDNA3-MDR1-Promoter-CD-TK.转染入细胞后PCR结果显示,CD、TK基因均整合入K562、K562/A02细胞中,RT-PCR结果显示,K562/A02/CD-TK细胞CD、TK基因有特异性条带表达,而K562/CD-TK细胞无特异性条带.结论:MDR1启动子调控的CD-TK双自杀基因真核表达载体的成功构建及其在K562/A02细胞中的特异性表达为耐药白血病的靶向性基因治疗提供了实验基础.
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胞嘧啶脱氨酶和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因治疗肝门部胆管癌的体内外实验研究
目的:观察逆转录病毒介导的胞嘧啶脱氨酶(E.Coli-cytosine deaminase,CD)基因、单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus-thymidine kinase,HSV-tk)基因转染肝门部胆管癌的作用.方法:在脂质体lipofectamine的介导下将含有双自杀基因的逆转录病毒载体PWZLneoCDglytk导入包装细胞PA317,收集其病毒上清,转染FRH细胞,用RT-PCR检测双自杀基因的表达.给予前体药物5-氟胞嘧啶(5-flourocytosine,5-Fc)和(或)无环鸟苷(ganciciovir,GCV)后,用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法测定转基因组及未转基因组FRH细胞存活率.在0.8 cm裸鼠肝门部胆管癌模型转染入双自杀基因后,给予5-Fc500 mg/kg体重,GCVl00 mg/kg体重,1次/d,共10 d,观察肿瘤生长情况.结果:双自杀基因在FRH细胞中可稳定表达,联合使用5-Fc和GCV对靶细胞增殖的杀伤作用及旁杀伤效应高于单独使用5-Fc或GCV.在裸鼠实验性肝门部胆管癌,实验组肿瘤的生长明显受到抑制(P＜0.05);双自杀基因与单自杀基因的作用有显著差异(P＜0.05).结论:逆转录病毒介导自杀基因可有效地杀死肝门部胆管癌细胞,明显抑制裸鼠肝门部胆管癌生长,双自杀基因共表达较单一自杀基因有更强的抗肿瘤作用.
