首页 > 文献资料
-
Slug真核表达载体构建及功能鉴定
目的 在肿瘤发生和发展过程中,上皮细胞-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是上皮来源恶性肿瘤细胞获得侵袭、转移能力的重要生物学过程,并且与乳腺癌干细胞的生物学特性密切相关.本研究通过构建Slug的慢病毒真核表达载体,探讨Slug基因与EMT之间的关系及对乳腺癌干细胞生物学特性的影响.方法 以军事医学科学院(生物工程研究所)保存的乳腺cDNA文库为模板,通过PCR扩增出Slug的全长编码序列,将其克隆到经BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切的PCDH表达载体上,构建成PCDH-Slug真核表达载体,在人293T细胞中转入空载体和重组质粒,利用蛋白质印迹法检测PCDH载体介导的Slug的表达.后将包装质粒共转染293T细胞,包装病毒,感染ZR75-1细胞,经Puro(嘌呤霉素)筛选2周后,得到稳定表达Slug的ZR75-1细胞株,检测ZR75-1细胞对EMT的影响.并将稳定表达Slug的ZR75-1稳定细胞接种于的Matrigel基质胶,倒置显微镜观察ZR75-1稳定细胞株的成管特性.结果 从乳腺文库中获得Slug的全长编码序列,经BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切及DNA测序证实得到PCDH-Slug表达载体,PCDH-Slug真核表达载体和PCDH分别转染293T细胞后,经过蛋白质印迹法检测Slug在293T细胞内有显影,对照组明显减弱,表明Slug-PCDH载体携带的Slug编码序列能够在293T细胞中成功;通过增加puro的含量进行筛选,得到稳定表达的混合克隆即能表达Slug的ZR75-1细胞株,经蛋白质印迹法检测PCDH-Slug 对E-cadherin的影响,以GAPDH为内参,结果比对照组的表达减弱,与预期相符,表明PCDH-Slug载体可以使细胞中E-cadherin的表达减弱;倒置显微镜下ZR75-1稳定细胞株成管明显,表明Slug可以通过调节EMT使乳腺癌细胞具有某些干性特征.结论 调节Slug基因表达可以影响EMT相关蛋白的表达,并以此影响乳腺癌干细胞的生物学特性.
关键词： 乳腺癌 Slug 上皮细胞-间质转化 成管 E-cadherin -
大鼠骨髓源性间充质干细胞对内皮细胞增殖及成管的影响
目的 观察大鼠骨髓源性间充质干细胞(MSCs)对内皮细胞(ECs)增殖及成管能力的影响.方法 采用密度梯度离心、流式细胞仪及免疫荧光的方法将不同培养条件下(DMEM及EGM-2培养液)大鼠骨髓源性单核细胞(BM-MNCs)进行分离及鉴定,并对直接和间接共培养(Transwells)的细胞进行体外成管和免疫荧光统计分析.结果 与DMEM中的细胞比较,EGM-2培养的BM-MNCs能够形成典型的集落形成细胞.流式细胞仪检测和免疫荧光鉴定表明培养在DMEM和EGM-2中的细胞分别为MSCs(CD105、CD90和CD73表达率大于95％)和ECs(CD31阳性率大于90％).与间接共培养比较,直接共培养后细胞的成管数量及长度均显著降低(P＜0.05).免疫荧光染色进一步证明,直接共培养后ECs的数量湿著减少(P＜0.05).结论 直接共培养下,大鼠MSCs能够抑制ECs的增殖及成管.
-
Anip973细胞上清液增加脐静脉内皮细胞的生物活性
背景与目的肿瘤微血管内皮细胞与正常组织来源的微血管内皮细胞相比，具有对生长因子反应性高、粘附因子表达高等特点，造成肿瘤血管通透性高且新生旺盛，导致肿瘤的快速生长和转移。因此了解肿瘤微环境中内皮细胞发生、形态及功能上的异质性特点，对进行合理的、个性化的、以血管内皮细胞为靶点的抗血管新生治疗有一定的指导作用。本实验旨在研究高转移肺腺癌Anip973细胞培养上清液对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell, HUVEC）表面标记及其生物学行为的影响。方法以含有不同浓度Anip973细胞上清液的培养基（RPMI-1640+10%胎牛血清）培养的HUVEC为实验组、单纯培养基培养的HUVEC为对照组，以CCK-8检测各组细胞增殖率、基质胶成管实验检测成管能力、Transwell检测迁移能力、流式细胞术检测细胞表面标记CD105、CD31以及凋亡标记Annexin V的表达，并分析细胞表面标记的表达与生物学行为之间的关系。结果与对照组相比，经Anip973细胞上清液培养的HUVEC增殖更多、且在浓度为250μL/mL作用24 h明显（P=0.002）；成管及迁移能力亦均较对照组增强，分别在浓度为125μL/mL （P<0.001）、250μL/mL（P=0.002）时达强；细胞表面标记CD105表达阳性率升高、浓度为250μL/mL （P=0.028）明显；CD31表达阳性率呈浓度依赖性升高；凋亡细胞比例降低。相关性分析显示：CD105的表达阳性率与细胞增殖及迁移能力呈正相关关系、CD31的表达与生物学行为并无明显相关性。结论 Anip973细胞上清液能促进HUVEC细胞增殖、迁移、血管形成，CD105也随之变化、并可在一定程度上反应其生物学行为。
