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重组人色素上皮衍生因子在真核细胞SP2/0中的瞬时表达及活性鉴定
目的 构建抑制早产儿视网膜病新生血管形成的重组人色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)真核表达载体,检测其在小鼠骨髓瘤细胞SP2/0中的瞬时表达.方法 根据已知的GenBank中人PEDF cDNA成熟蛋白编码区序列设计特异性引物,以全基因合成的pUC57-PEDF质粒为模板,经聚合酶链反应技术扩增人PEDF基因,定向克隆至真核表达载体pIRESneo3中,获得重组表达质粒pIRESneo3-PEDF.将重组质粒pIRESneo3-PEDF与脂质体转染试剂LipofectamineTM 2000混合后转染小鼠骨髓瘤细胞SP2/0,采用酶联免疫吸附试验及Western印迹对表达产物进行鉴定.收集转染细胞培养液上清,采用四甲基偶氮唑盐比色法检测重组PEDF活性.结果 聚合酶链反应技术、酶切鉴定和测序结果表明,pIRESneo3-PEDF表达载体构建成功.脂质体法将表达质粒成功转染到SP2/0中,经培养,可分泌表达PEDF,且经Western印迹检测证明为人PEDF,分子量为50 000.转染36 h上清液中PEDF浓度高,为(0.92±0.04) μg/ml.转染36 h细胞培养液上清对人脐静脉内皮细胞的抑制作用强(P<0.05).结论 成功构建人PEDF真核表达质粒pIRESneo3-PEDF,转染细胞可瞬时分泌表达有活性的人PEDF,对人脐静脉内皮细胞增殖有抑制作用,为开展下一步稳定转染表达及蛋白纯化奠定基础,为早产儿视网膜病的防治带来新的希望.
