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克隆与表达产甲酸草酸杆菌代谢基因Frc及临床意义
目的 研究产甲酸草酸杆菌草酸代谢基因Frc转化大肠杆菌BL21后稳定表达代谢草酸相关性酶--甲酰辅酶A转移酶(FCoAT)对草酸的降解效能.方法 成功培养产甲酸草酸杆菌后,采用PCR方法从产甲酸草酸基因组中获得Frc基因,克隆到pMDTM19-T载体上进行测序,得到正确的基因片段.经双酶切将目的 基因片段插入到原核表达载体PGEX-4T-2上,测序正确后,转化大肠杆菌BL-21,IPTG诱导表达GST-FCoAT融合蛋白,表达产物行western-blot鉴定分析.结果 重组克隆载体pMDTM19-Frc经测序鉴定序列正确.成功构建融合原核表达质粒PGEX-4T-2-Frc,大肠杆菌BL21成为载体,并稳定表达可溶性融合蛋白GST-FCoAT的同时获得代谢草酸潜能.结论 克隆产甲酸草酸杆菌Frc基因,成功构建PGEX-4T-2-Frc载体,并转化大肠杆菌BL21,能稳定表达可溶性融合蛋白GST-FCoAT,具有代谢草酸潜能,为肠道细菌获得代谢草酸潜能,减少胃肠道内草酸的吸收,降低尿液中草酸含量和临床防治草酸结石的研究奠定理论基础.
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重组人PD-L1在大肠杆菌BL-21中的表达、纯化和鉴定
目的 分离纯化人程序死亡蛋白-1(PD-LI)基因,制备重组人PD-L1蛋白,为进一步研究PD-L1在肿瘤免疫逃逸中的作用和机制建立基础.方法 通过RT-PCR分离纯化人PD-L1基因,并将其克隆到原核表达质粒pGEX-4T一1中,经酶切,测序鉴定分析后,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达.产物经GST蛋白纯化系统进行纯化后,用10%SDS-PAGE及Western Blot分析鉴定.结果 经RT-PCR分离纯化的PD-L1 cDNA分子由645 bp构成,编码相对分子量约25 KD的蛋白,并与GST形成融合蛋白.GST-PD-L1融合蛋白相对分子量约46 KD.Western Blot结果显示,该蛋白能被兔抗GST和抗PD-L1抗体识别.结论 成功构建了PD-L1原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中获得高效表达.
