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小鼠骨髓间充质干细胞Osterix基因特异siRNA的设计和沉默作用
目的 探讨应用小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)特异性抑制骨髓间充质干细胞内Osterix基因表达,筛选高效特异性siRNA.方法 根据siRNA设计原则,针对Osterix基因序列特征设计Osterix特异siRNA(1-3),转染骨髓间充质干细胞,用QPCR和Western blot方法检测siRNA对Osterix基因的抑制效果.结果 Osterix siRNA-2可有效抑制骨髓间充质干细胞中Osterix基因的表达.随siRNA-2终浓度由50 nmol/L增加到100 nmol/L及200 nmol/L,抑制效率逐渐增强(P＜0.05);siRNA-2以终浓度200 nmol/L转染后48 h抑制效果强,72 h逐渐减弱,但仍明显抑制(P＜0.05).结论 应用RNA干扰技术可抑制骨髓间充质干细胞中Osterix基因的表达,其抑制作用具有明显的时间、浓度依赖性.
关键词： RNA干扰 Osterix基因 小鼠骨髓间充质干细胞 基因沉默 -
Oct-4在小鼠骨髓间充质干细胞定向诱导分化中的甲基化状态
目的 研究Oct-4在小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)定向诱导分化中的甲基化状态.方法 全骨髓贴壁筛选法培养小鼠BMSCs,通过形态学观察及免疫细胞化学进行鉴定.骨块接种培养法培养小鼠成骨细胞,采用碱性磷酸酶(AKP)及茜素红进行鉴定.诱导小鼠BMSCs向成骨细胞分化,采用间接免疫荧光染色和RT-PCR法观察Oct-4在小鼠BMSCs诱导分化前后的表达情况,甲基化特异性PCR检测Oct-4在小鼠BMSCs诱导分化前后的甲基化状态.结果 分离培养的小鼠BMSCs在体外能大量增殖,形成形态均一的细胞集落,培养细胞的CD29、c-Kit和CD44呈阳性表达,CD34呈阴性表达.诱导10d后的细胞及从小鼠颅骨中分离、培养出的成骨细胞,AKP及茜素红染色呈阳性.间接免疫荧光染色和RT-PCR结果显示,Oct-4在小鼠BMSCs定向诱导分化中表达下调.小鼠BMSCs定向诱导分化中Oct4基因启动子区的CpG岛出现了甲基化.结论 成功在体外培养了小鼠BMSCs及小鼠成骨细胞,Oct-4基因可能参与了成体干细胞多潜能性的维持,Oct-4基因在小鼠BMSCs定向诱导分化中的表达下调可能是其启动子区CpG岛甲基化的缘故.
关键词： Oct-4 小鼠骨髓间充质干细胞 分化 甲基化 -
间充质干细胞条件培养基对肺泡上皮液体清除能力的影响
目的 探讨小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)条件培养基对小鼠肺泡液体清除的影响和对人肺泡上皮细胞生存能力的作用,并明确小鼠BMSCs条件培养基在肺脏液体清除中的作用机制.方法 细胞贴壁法分离培养小鼠BMSCs,应用流式细胞术对小鼠BMSCs的表面标记物进行鉴定;运用酶标仪测定小牛血清白蛋白浓度的方法测定小鼠在体肺泡液体清除率;利用活细胞计数盒(CCK-8)试剂研究小鼠BMSCs条件培养基对人H441肺泡上皮细胞生存能力的影响;采用蛋白质印迹法研究小鼠BMSCs条件培养基对人肺泡上皮细胞钠通道蛋白水平的影响.结果 小鼠BMSCs稳定表达CD44,阴性表达CD34;小鼠BMSCs条件培养基能够提升在体小鼠肺泡液体清除率;小鼠BMSCs的条件培养基能够提高人肺泡上皮细胞的生存能力;蛋白质印迹法结果显示小鼠BMSCs条件培养基能够增加人肺泡上皮细胞钠通道的蛋白水平表达.结论 小鼠BMSCs条件培养基能够增强肺泡上皮细胞的液体清除并能改善其生存能力,机制可能与肺泡上皮细胞钠通道蛋白表达的增加有关.
关键词： 小鼠骨髓间充质干细胞 肺泡液体清除 肺泡上皮细胞 钠通道 -
过表达GATA-4骨髓间充质干细胞以外泌体修复心肌损伤的相关microRNA
背景:GATA-4是与心脏发育特异相关的锌指样转录因子,前期实验发现过表达GATA-4的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分泌的外泌体(exosome)与BMSCs共培养时可以促使BMSCs表达出更多的心肌特异性抗原.当其与心肌细胞在低氧环境下培养可以抑制心肌细胞的凋亡.目的:探讨过表达GATA-4的BMSCs分泌exosome修复心肌损伤的相关microRNA,从分子水平对其生物学效应进行探讨.方法:①通过慢病毒载体GV308携带GATA-4转染小鼠BMSCs,构建过表达GATA-4小鼠BMSCs,并加入基因开启剂强力霉素,然后采用ExoQuick-TC法提取分泌的exosome;②实验设5组:GATA-4-BMSCs-exosome+BMSCs共培养组、空载体-BMSCs-exosome+BMSCs共培养组、BMSCs-exosome+BMSCs共培养组、BMSCs单独培养组、心肌细胞单独培养组.培养24 h采用Q-PCR定量检测心肌特异性抗原cTnT、α-actin、connexin 43、Desmin的表达;③实验设5组:GATA-4-BMSCs-exosome+心肌细胞共培养组、空载体-BMSCs-exosome+心肌细胞共培养组、BMSCs-exosome+心肌细胞共培养组、心肌细胞单独培养组,在低氧(体积分数为1%)无血清培养条件下培养24 h诱导细胞凋亡.以正常条件下单独培养的心肌细胞作为阴性对照组,采用流式细胞技术检测各组细胞的凋亡率;④采用Agilent microRNA芯片检测过表达GATA-4小鼠BMSCs分泌exosome内有关细胞分化及抗凋亡的microRNA.结果与结论:①Q-PCR和流式细胞技术检测结果显示:过表达GATA-4-BMSCs分泌的exosome可以有效促进BMSCs向心肌细胞转化且具有极强的抗凋亡能力;②Agilent microRNA芯片检测结果显示:涉及细胞分化的关键microRNA:mmu-miR-199a-3p(microRNA为上调);mmu-miR-1894-5p(microRNA为下调).涉及细胞抗凋亡的关键microRNA:mmu-miR-199a-3p、mmu-miR-20a-5p、mmu-miR-330-3p,这3个基因均为上调.其中mmu-miR-199a-3p即涉及细胞分化又涉及细胞抗凋亡,为重点首先需要验证的microRNA.
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改性PET材料编织物引导小鼠BMSC迁移模型的建立
目的:壳聚糖接枝改性的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)纤维编织材料是一种具有良好组织相容性的新型生物材料,小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)为主要的人工韧带种子细胞.本研究通过建立一种可应用于生物材料上的细胞迁移模型,旨在观察BMSC在改性PET材料编织物上的迁移能力,探讨该材料作为人工韧带应用的可行性.方法:利用316L医用不锈钢自主设计制作细胞迁移模具,置于六孔板,在模具加样孔内接种小鼠BMSC,培养24h后撤出模具,分别继续培养48 h、72 h和96h；在证实模具可有效用于量化细胞迁移过程后,将不同线密度的PET材料编织物平铺于六孔板底,利用本模型观察BMSC在3000D组和5000D组经改性的PET材料编织物上的迁移能力,吉姆萨染色法计算不同时间点BMSC的迁移面积.结果:细胞接种24 h后撤出模具,可见六孔板底中央出现与模具底面大小相当的无细胞空白区,周围接种BMSC,随培养时间延长,BMSC逐渐由周围向中央区域迁移；在经改性的PET材料编织物上成功建立细胞迁移模型后,随培养时间增加,两组细胞迁移面积均逐渐增大,其中3000D组细胞迁移面积显著大于5000D组(P＜0.05).结论:利用316L医用不锈钢模具建立的细胞迁移模型能够应用于平铺编织物引导细胞迁移的基础研究,本模型可作为传统模型无法观察人工材料对细胞迁移可能影响的良好补充；3000D经改性的PET材料编织物的线密度较5000D更有利于小鼠BMSC在材料上的迁移和生长.
关键词： 聚对苯二甲酸乙二醇酯 小鼠骨髓间充质干细胞 细胞迁移 材料编织物 人工韧带 -
小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养新方法
目的 探讨一种新的小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养方法.方法 分离小鼠3 d乳鼠双后肢,剔除肌肉筋膜组织,剪碎后接种于含10％胎牛血清的α-MEM中,观察细胞形态学变化,采用CCK8检测细胞增殖能力,绘制细胞生长曲线,采用流式细胞技术鉴定细胞表面抗原,并进行多向分化潜能鉴定.结果 原代分离培养的小鼠骨髓间充质干细胞呈长梭形,从骨片周围爬出,传代后,细胞形态一致,生长良好;绘制的细胞生长曲线呈"S"型,流式细胞表型鉴定结果显示,培养的细胞高表达CD90、CD29,低表达CD11b、CD45,成脂油红O染色和成骨茜素红染色均呈阳性.结论 采用小鼠3 d乳鼠骨片法能够成功培养出骨髓间充质干细胞,骨髓间充质干细胞可作为肝脏组织工程的种子细胞.
关键词： 小鼠骨髓间充质干细胞 分离 培养 肝脏组织工程 -
低氧培养促进小鼠骨髓间充质干细胞的增殖
目的 小鼠骨髓间充质干细胞(Murine bone marrow stem cells,mBMSCs)体外培养增殖相对缓慢,细胞表型会逐渐丧失.本研究采用低氧培养观察mBMSCs的增殖和表型维持情况,以期寻找一种更简便和快速扩增mBMSCs的方法.方法 用低氧浓度(4%O2)和常规氧浓度(20%O2)培养、扩增mBMSCs,观察比较两种氧浓度培养的细胞增殖速度、细胞形态和细胞周期分析等.结果 低氧浓度(4%O2)促进mBMSCs增殖,同代次细胞倍增时间明显短于常规氧浓度(20%O2)细胞;相比低氧浓度(4%O2),常规氧浓度(20%O2)培养的细胞更容易发生去分化.在细胞周期分析中,低氧浓度培养的mBMSCs处于复制期的比例高于常规氧浓度培养细胞的比例.结论 低氧(4%O2)培养可以促进mBMSCs增殖,是一种简便的体外迅速扩增mBMSCs的较好方法.
关键词： 低氧培养 小鼠骨髓间充质干细胞 增殖 -
小鼠骨髓间充质干细胞SCA-1+ /CD45+ /CD31+亚群自身抗凋亡基因研究
目的 探讨小鼠骨髓间充质干细胞( BMSCs )亚群SCA-1 + /CD45 + /CD31 +抗凋亡的分子基础. 方法 以小鼠心脏干细胞表面分化抗原检测BMSCs后以CD45、CD31 为标准分选得到4个亚群. 体外将4个亚群采用无血清低氧(5%)培养,流式细胞术检测各组的凋亡率. 分别将细胞注入心梗48 h小鼠体内于注射后48 h完成心功能测定. 可见SCA-1 + /CD45 + /CD31 +组抗凋亡能力强,心脏彩超提示心功能恢复亦优于其他各组. 采用基因芯片完成Agilent小鼠全基因 4 × 44K 芯片从分子水平对 SCA-1 + /CD45 + /CD31 +亚群抗凋亡能力进行探讨. 结果 将 SCA-1 + /CD45 + /CD31 +与其他组有关于凋亡基因进行聚类分析及Network结果共同比较可见两者无交集,以上述差异基因4倍表达为标准,因而以 Network 结果为主. 可见 NFkB1、RB1、E2F1为感兴趣基因. 结论 小鼠BMSCs为一多克隆的细胞群体. SCA-1 + /CD45 + /CD31 +抗凋亡及改善心功能方面优于其他亚群;其分子机制在于 NFkB1、RB1、E2F1 基因表达较其他亚组多见.
关键词： 小鼠骨髓间充质干细胞 亚群 基因 -
采用高速离心及ExoQuick-TC法提取小鼠骨髓间充质干细胞来源外泌体比较及鉴定
比较及鉴定超高速离心法及ExoQuick-TC法提取小鼠骨髓间充质干细胞来源外泌体.采用BCA蛋白检测可见ExoQuick-TC法提取的外泌体蛋白含量高于超高速离心法提取的蛋白含量.Exosome Antibodies,Array & ELISA Kits检测可见ExoQuick-TC法提取外泌体的纯度优于超高速离心法提取的纯度.两种方法提取的外泌体电镜下形状无差异,随机选取3个电镜视野进行计数可见ExoQuick-TC法提取外泌体数量多于超高速离心法提取外泌体. ExoQuick-TC法提取的外泌体具有更高的产量及纯度.
关键词： 外泌体 小鼠骨髓间充质干细胞 超高速离心 ExoQuick-TC法 -
小鼠骨髓间充质干细胞SCA-1+/CD45+/CD31+亚群归巢基因研究
目的:探讨小鼠骨髓间充质干细胞(mBMSCs)亚群SCA-1+/CD45+/CD31+归巢分子基础.方法:以小鼠心脏干细胞表面分化抗原检测mBMSCs后,以CD45、CD31为标准分选得到4个亚群.体外将4个亚群采用transwell小室,检测各组的归巢能力.分别将各亚群细胞注入心肌梗死48 h模型.小鼠体内注射后48 h、96h、7d处死小鼠取其心脏,完成小动物活体成像并检测其荧光强度.可见SCA-1 +/CD45+/CD31+组归巢能力优于其他各组.而后采用基因芯片完成Agilent小鼠全基因4×44K芯片,从分子水平对SCA-1+/CD45+/CD31+亚群归巢能力进行探讨.结果:将SCA-1+/CD45+/CD31+亚群与其他亚群有关归巢基因的聚类分析及Network分析的结果比较可见,Dcx及MADCAM1基因为两结果交集,是有关归巢的关键基因.结论:mBMSCs为一多克隆的细胞群体.SCA-1’/CD45+/CD31+亚群归巢能力方面优于其他亚群;其分子机制在于Dcx及MADCAM1基因表达较其他亚组多见.
关键词： 小鼠骨髓间充质干细胞 亚群 归巢 基因 -
小鼠骨髓间充质干细胞SCA-1+/CD45+/CD31+亚群向心肌样细胞分化的分子基础
目的:探讨小鼠骨髓间充质干细胞(mBMSCs)亚群SCA-1+/CD45+/CD31+向心肌样细胞分化的分子基础.方法:以小鼠心脏干细胞表面分化抗原检测mBMSCs后以CD45、CD31为标准分选得到4个亚群.各亚群和心肌细胞共培养后检测α-actin、Cx43、Desmin、cTnI的表达.并采用基因芯片完成Agilent小鼠全基因4* 44K芯片从分子水平对各亚群和心肌细胞共培养结果进行探讨.结果:SCA-1+/CD45+/CD31+亚群和心肌细胞共培养后更易表达出心肌细胞标志性分子.通过Agilent小鼠全基因4*44K芯片将SCA-1+/CD45+/CD31+与其他组的心血管发育基因的聚类分析及Network结果共同比较可见两者无交集,以差异基因均为4倍表达为标准,因而以Network结果为主.可见:SETD2、NCL、EPOR、Rock2为感兴趣基因.结论:mBMSCs为多克隆的细胞群体.SCA-1+/CD45+/CD31+在向心肌定向分化及改善心功能方面优于其他亚群,其分子机制在于SETD2、NCL、EPOR、Rock2基因表达较其他亚组多见.
关键词： 小鼠骨髓间充质干细胞 亚群 基因 -
小鼠骨髓间充质干细胞SCA-1+/CD45+/CD31+亚群抗凋亡能力的研究
目的:探讨小鼠骨髓间充质干细胞(mBMSCs)各亚群在心肌修复中抗凋亡能力.方法:以小鼠心肌干细胞表面分化抗原检测mBMSCs后以CD45、CD31为标准分选得到小鼠骨髓间充质干细胞4个亚群.体外将4个亚群采用无血清低氧(5％)培养,流式细胞仪检测各组的凋亡率.分别将细胞注入小鼠心梗模型体内,注射后48h完成心功能测定.结果:SCA-1+/CD45+/CD31+组抗凋亡能力强,心脏彩超提示心功能恢复亦优于其他各组.结论:小鼠骨髓间充质干细胞SCA-1+/CD45+/CD31+组抗凋亡能力明显优于其他组,治疗后心功能恢复亦优于其他各组.
关键词： 小鼠骨髓间充质干细胞 亚群 心肌梗死 抗凋亡 -
过表达GATA-4骨髓间充质干细胞通过外泌体修复心肌损伤的探讨
目的:探讨过表达GATA-4小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)通过分泌外排体(exosome)修复心肌损伤的机制.方法:通过慢病毒载体GV308携带GATe4转染小鼠BMSC构建过表达GATA-4小鼠BMSC并加入基因开启剂——强力霉素(DOX),然后采用SBI公司的ExoQuick-TC提取分泌的exosome.通过电镜检测exosome的形态.经尾静脉注射采用Dir预染的过表达GATA-4-BMSCs分泌的exosome(过表达GATA-4组)、空载体-BMSCs分泌的exosome(空载体组)、BMSCs细胞分泌的exosome(BMSCs组),将不给予任何处理的心肌梗死(心梗)模型小鼠及正常喂养的小鼠分别设为未处理组和对照组.采用心脏彩超检测给予干预措施96 h的心功能改善情况.进而采用小动物活体成像检测心梗局部Dir荧光强度.番茄凝集素评估心梗局部血管生成及采用免疫组化检测心梗局部C-kit阳性细胞的数量.结果:过表达GATe4组较其他组可以更好地改善心梗后的心功能,射血分数及环比收缩改善幅度大.过表达GATA-4组较其他组在96 h时心脏局部可见更高荧光强度.番茄凝集素实验可见:过表达GATA-4组较其他组在给予干预措施后96 h,可以表达出更多的血管.C kit免疫组织化学检测可见:过表达GATA-4组较其他组在给予干预措施后96h,心梗局部C-kit细胞数量较其他组多.结论:过表达GATA-4的BMSCs可以通过分泌的exosome增强“归巢”效应、促进心梗局部血管增生、有效动员C-kit阳性细胞修复心肌损伤.
关键词： GATA-4 外排体 小鼠骨髓间充质干细胞 心肌梗死 -
过表达GATA-4骨髓间充质干细胞通过外排体修复心肌损伤的机制
目的:探讨过表达GATA-4小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)通过分泌外排体(exosome)修复心肌损伤的机制.方法:构建过表达GATA-4的小鼠BMSCs并提取其分泌的exosome.而后将GATA-4-BMSCs-ex-osome与BMSCs共同培养,空载体-BMSCs-exosome与BMSCs共同培养,BMSCs-exosome与BMSCs共同培养、BMSCs单独培养及小鼠心肌细胞单独培养48 h,采用Q-PCR定量检测心肌肌钙蛋白T(cTnT)、α肌动蛋白(α-actin)、连接蛋白43 (connexin 43)、结蛋白(Desmin)心肌特异性抗原表达量.再将过表达GATA-4BMSCs分泌的exosome与心肌细胞共培养,空载体-BMSCs分泌的exosome与心肌细胞共培养,BMSCs分泌的exosome与心肌细胞共培养及心肌细胞单独用于低氧培养无血清培养诱导细胞凋亡作为阳性对照培养48 h诱导细胞凋亡.采用流式细胞技术检测各组细胞的凋亡率.进一步采用TMT标记定量蛋白质组学分析过表达GATA-4小鼠BMSCs分泌exosome内有关细胞分化及抗凋亡的蛋白.结果:Q-PCR显示:过表达GATA-4-BMSCs分泌的exosome可以有效促进BMSCs向心肌细胞转化并具有极强的抗凋亡能力.蛋白质谱提示有8个蛋白有关细胞分化.有6个蛋白有关细胞调亡.其中Slit homolog 2 protein及Connective tissue growth factor蛋白既涉及细胞凋亡又涉及细胞分化.结论:过表达GATA-4-BMSCs分泌的exosome可以促进BMSCs向心肌细胞分化并具有抗凋亡能力.Slit homolog 2 protein及Connective tissue growth factor蛋白既涉及细胞凋亡又涉及细胞分化.
关键词： GATA-4 Exosome 蛋白 小鼠骨髓间充质干细胞 -
小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中Caveolin-1的表达
目的:探讨小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化过程中小窝蛋白-1 (Caveolin-1)的表达变化.方法:体外培养BMSCs细胞株,分为诱导成骨组和未诱导组,在培养的不同时期(3 d、7d、10d、14 d),采用碱性磷酸酶(AKP)活性测定、茜素红染色对BMSCs成骨分化进行鉴定,实时聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction RT-PCR)、蛋白质印迹法(Western Blot)检测各组细胞Caveolin -1 mRNA、蛋白的表达情况.结果:RT-PCR结果显示同一时间点诱导组Caveolin-1 mRNA表达量高于未诱导组,诱导组Caveolin-1 mRNA表达以时间依赖性的方式不断增高;Western Blot结果显示同一时间点诱导组Caveolin-1蛋白水平高于未诱导组,诱导组Caveolin-1蛋白水平以时间依赖性的方式增高.结论:本实验从mRNA、蛋白水平证实BMSCs表达Caveolin-1的量随着成骨分化的进行不断增加.Caveolin-1可能参与调控BMSCs成骨分化过程.
关键词： 小鼠骨髓间充质干细胞 成骨分化 小窝蛋白-1 -
糖基化终末产物对小鼠骨髓间充质干细胞增殖及相关基因P27、cyclinD1的影响
目的:探讨糖基化终末产物(AGEs)对小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖能力以及相关基因P27、cyclinD1的影响.方法:全骨髓法培养小鼠骨髓间充质干细胞;成骨、成脂诱导骨髓间充质细胞,对其进行干细胞鉴定;将培养出的骨髓间充质干细胞与不同浓度的AGEs共培养,MTT检测不同浓度下骨髓间充质干细胞增殖的改变;实时定量聚合酶链反应(Real time PCR)检测AGEs刺激后P27、cyclin D1表达的改变.结果:小鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导21d后茜素红染色出现钙化结节;成脂诱导21 d后油红O染色出现脂滴;MTT显示不同浓度的AGEs(10、50、100、200 mg/L)均能抑制BMSCs的增殖差异有统计学意义(P＜0.05),且随着浓度的增加抑制越明显;Real time PCR结果显示:AGEs(50 mg/L)刺激3d后P27 mRNA的表达水平较对照组升高,cyclinD1 mRNA 的表达水平较对照组降低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:AGEs能抑制小鼠骨髓间充质干细胞的增殖并能改变P27、cyclinD1 mRNA的表达.
关键词： 糖基化终末产物 小鼠骨髓间充质干细胞 增殖 -
小鼠骨髓间充质干细胞SCA-1+/CD45+/CD31+亚群在心肌梗死中的作用
目的:探讨小鼠骨髓间充质干细胞(mBMSCs)亚群SCA-1 +/CD45+/CD31+在心肌修复中作用.方法:以小鼠心脏干细胞表面分化抗原检测mBMSCs后以CD45、CD31为标准分选得到四个亚群.各亚群及未分选群和心肌细胞共培养后检测α-actin、Cx43、Desmin、cTnI的表达.将SCA-1 +/CD45+/CD31+注入心梗小鼠体内完成心功能测定及心脏DIR成像检查.结果:各组均表达心肌特异性分化抗原.SCA-1+/CD45+/CD31+表达的量更多.心脏彩超及心脏DIR成像提示SCA-1 +/CD45+/CD31+改善心功能方面优于其他亚群及未分选群.结论:mBMSCs为一多克隆的细胞群体.SCA-1 +/CD45+/CD31+向心肌定向分化及改善心功能方面优于其他亚群.
关键词： 心肌梗死 小鼠骨髓间充质干细胞 亚群
