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肿瘤坏死因子-α削弱谷氨酰胺促大鼠骨骼肌蛋白质合成的途径
目的:研究肿瘤坏死因子-α (TNF-α)对谷氨酰胺促大鼠骨骼肌蛋白质合成及对细胞膜谷氨酰胺载体ASCT2 mRNA和蛋白表达的影响,揭示TNF-α影响谷氨酰胺促蛋白质合成的途径.方法:30只雄性SD大鼠,随机分为3组:对照组,谷氨酰胺组(Gln组)和谷氨酰胺+肿瘤坏死因子组(Gln+ TNF-α组).所有大鼠均行72 h全肠外静脉营养(TPN).对照组给予普通TPN;Gln组给予添加丙氨酰谷氨酰胺二肽的肠外营养,谷氨酰胺剂量为0.3 g·kg-1·d-1;Gln+ TNF-α组TPN方法同Gln组,并于实验结束前24 h持续静脉滴注TNF-α(5 μg·kg-1·h-1).所有大鼠均于取材前0.5 h一次性静脉注射L-15N亮氨酸1.0 mmol/kg.TPN后72 h分别取血和下肢骨骼肌,测定血浆TNF-α浓度(双抗体夹心ELISA法)、血浆和骨骼肌Gln浓度(高效液相色谱分析法)、骨骼肌蛋白质分数合成率(质谱仪测定后计算)、载体ASCT2 mRNA(RT-PCR方法)及蛋白(Western Blot法)表达水平.结果:Gln+ TNF-α组血浆TNF-α浓度显著高于其他两组;Gln+ TNF-α组血浆及骨骼肌中谷氨酰胺浓度高;Gln组和Gln+ TNF-α组骨骼肌中蛋白质合成率均高于对照组,并且Gln组高,各组间差异显著(P＜0.01).对照组ASCT2 mRNA表达低(P＜0.01),而另两组间差异无显著性(P＞0.05).3组ASCT2蛋白均有表达,Gln组显著高于对照组和Gln+ TNF-α组(P＜0.01).结论:TNF-α能够升高大鼠血浆及骨骼肌中谷氨酰胺的浓度,削弱谷氨酰胺的促蛋白质合成作用;其途径是抑制谷氨酰胺载体蛋白的合成,降低了骨骼肌细胞对谷氨酰胺摄入,导致组织蛋白质合成下降.
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Syncytin及其受体ASCT2 mRNA在正常妊娠和子痫前期胎盘中的表达
目的 研究人内源性逆转录病毒的膜糖蛋白syncytin及其受体ASCT2 mRNA在正常妊娠和子痫前期胎盘中的表达差异.方法 应用实时定量RT-PCR测定正常妊娠晚期胎盘组织(11例)和子痫前期胎盘组织(11例)中syncytin及其受体ASCT2 mRNA的相对表达量.结果 syncytin mRNA在两组中均有表达,其在子痫前期胎盘的表达明显低于正常妊娠晚期胎盘的表达(P＝0.0024).ASCT2 mRNA在两组中表达差异无显著性(P＝0.1877).结论 syncytin mRNA表达下降,可能与子痫前期的病因及病理生理有关.
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Syncytin及其受体ASCT2在子(癎)前期胎盘的表达以及缺氧对其表达的影响
目的 研究syncytin及其受体ASCT2在胎盘发育、子(癎)前期胎盘中的表达以及缺氧对两者表达的影响.方法 实时PCR检测syncytin及ASCT2 mRNA的表达.比较25例正常妊娠胎盘(分妊娠7～12周、30～36周和37～40周三组)syncytin和ASCT2表达的不同;比较8例子(癎)前期胎盘与正常妊娠胎盘syncytin及ASCT2表达的不同;比较正常和缺氧条件下forskolin诱导BeWo细胞分化成合体滋养细胞时,syncytin及ASCT2 表达的变化.结果 ①与妊娠7～12周相比,syncytin mRNA的表达在妊娠30～36周显著增加(P＜0.05),妊娠37周后减少,但仍高于妊娠7～12周(P＜0.05),ASCT2 mRNA妊娠30～36周起减少(P＜0.05),以后一直维持较低水平.②将对照组胎盘和子(癎)前期组胎盘孕周匹配后比较发现,子(癎)前期组胎盘syncytin mRNA表达减少(P＜0.01),ASCT2 mRNA表达无明显变化.③ BeWo细胞分化成合体滋养细胞时,伴syncytin mRNA表达增加和ASCT2 mRNA表达降低(P＜0.05),缺氧抑制syncytin mRNA的表达(P＜0.05),对ASCT2 mRNA的表达无明显影响.结论 Syncytin及其受体ASCT2在胎盘的表达与孕周有关,并参与合体滋养细胞形成的调控,子(癎)前期合体滋养细胞异常可能与缺氧导致syncytin表达异常有关.
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Na+-依赖性谷氨酰胺载体ASCT2的生物学功能及表皮生长因子的调控作用
目的:Na+-依赖性中性氨基酸载体ASCT2,是一种广谱的氨基酸载体,它的生理功能主要是转运肠腔内谷氨酰胺、丙氨酸、丝氨酸和半胱氨酸等中性氨基酸.本研究拟对ASCT2载体转运特性及表皮生长因子对其的调控机制作一探讨. 方法:体外培养Caco-2细胞,观察ASCT2对核素标记谷氨酰胺的转运特性、动力学特征及底物特异性;利用ASCT2多克隆抗体及TaqMan实时定量PCR方法,研究表皮生长因子对ASCT2功能的调控作用. 结果:Caco-2细胞中Na+-依赖性3H-L-谷氨酰胺(50 μmol)的转运速率为(635±80.1) pmol/(mg protein·min),大部分中性氨基酸如丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸等可对其产生竞争性抑制;在表皮生长因子(100 μg/L)孵育下,可以提高其转运活性约100%(P＜0.01),Western-blot及real-time PCR显示其蛋白及mRNA表达增高. 结论:谷氨酰胺载体ASCT2对核素标记谷氨酰胺具有强大的转运活性,对中性氨基酸底物具有亲和特异性;表皮生长因子对其转运活性、蛋白表达、mRNA丰度具有上调作用.
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肿瘤坏死因子对谷氨酰胺促大鼠小肠蛋白质合成的影响及途径
目的 谷氨酰胺(glutamine,Gln)需经过载体转运至细胞内才能被利用,感染状态下Gln疗效不佳.肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)是感染中重要的调节因子,故研究TNF-α与Gln促蛋白质合成及其与Gln载体之间的关系对揭示感染状态下Gln代谢途径、提高疗效具有重要意义.文章研究TNF-α对Gln促大鼠小肠蛋白质合成及其对细胞膜Gln载体ASCT2mRNA、蛋白表达的影响,揭示TNF-α影响Gln促蛋白质合成的途径.方法 30只雄性SD大鼠按单纯随机法分3组:对照组、Gln组和TNF-α组.所有大鼠均行3d全肠外静脉营养.对照组仅给予普通全肠外营养;Gln组给予添加丙氨酰谷氨酰胺二肽的肠外营养,Gln剂量为0.3g/(kg·d),计72h;TNF-α组给予添加丙氨酰谷氨酰胺二肽的肠外营养,并在第3天持续24h静脉滴注TNF-α,速度5μg/(kg·h).所有大鼠均在取材前0.5h一次性静脉注射[L-15N]亮氨酸,剂量1.0mmol/kg.实验结束时分别测定血浆TNF-α、Gln浓度、小肠Gln浓度、蛋白质合成率、ASCT2载体mRNA及蛋白表达水平.结果 TNF-α组血浆TNF-α浓度显著高于其他2组;TNF-α组血浆及小肠中Gln浓度高;Gln组和TNF-α组小肠中蛋白质合成率均高于对照组,且Gln组高;以上各组之间差异有统计学意义(P＜0.01).对照组ASCT2的mRNA及蛋白表达均显著低于其他2组(P＜0.01).Gln组ASCT2的蛋白显著高于其他2组(P＜0.01).结论 TNF-α能够升高大鼠血浆及小肠中Gln的浓度,抑制Gln的促蛋白质合成作用,其途径是TNF-α抑制氨基酸载体的转运功能,Gln不能顺利进入细胞,导致组织蛋白质合成下降,这种抑制发生在翻译及以后水平.
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应用RNA干扰技术检测ASCT2功能
目的 谷氨酰胺( glutamine,GLM)是肠道细胞的主要氧化燃料,必须通过载体的转运才能进入细胞内,其中载体ASCT2起重要作用,文中将应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术研究肠黏膜上皮细胞株(intestinal epithelial cell,IEC)-6细胞膜GLN载体ASCT2的转运功能.方法 体外培养IEC-6,RNAi慢病毒颗粒进行细胞感染,3d后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达情况,5d后采用RT-PCR检测载体ASCT2的mRNA表达,7d后采用Western blot检测其蛋白表达,同时测定[3H]-L-GLN摄取率.结果 病毒转染细胞中均有GFP表达,载体ASCT2的mRNA表达下降60％,蛋白表达几近消失,[3H]-L-GLN摄取率下降15％.结论 通过慢病毒载体介导的RNAi这一方便有效的方法,证实了ASCT2载体在整个细胞的GLN转运中起15％以上的作用.
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肠黏膜上皮细胞的载体分布及功能
目的:谷氨酰胺是肠道细胞的主要氧化燃料,必须通过载体的转运才能进入细胞内.研究IEC-6细胞膜上分布的谷氨酰胺载体种类及其功能. 方法:体外培养肠黏膜上皮细胞株IEC-6,检测细胞膜上不同谷氨酰胺载体(ASCT2、SN1、SN2、ATA1、ATA2、LAT1、LAT2)的mRNA;检测载体ASCT2蛋白;测定不同载体对同位素标记谷氨酰胺的转运特性. 结果:在IEC-6细胞膜上载体ASCT2、SN1、ATA1、LAT1、LAT2的mRNA均得以表达.细胞外缓冲液中Na+存在时,[3H]-谷氨酰胺摄取率为(164.07±37.94)fmol/(mg protein·10min);Na+不存在时,[3H]-谷胺酰胺摄取率为(58.71±10.51)fmol/(mg protein·10min);饱和剂量甲氨基异丁酸(methylamino-isobutyric acid,MeAIB)阻断A类载体后,[3H]-谷氨酰胺摄取率为(81.02±19.59)fmol/(mg protein·10min). 结论:在IEC-6细胞膜上可能存在载体ASCT2、SN1、ATA1、LAT1、LAT2;Na+依赖性氨基酸载体起主要作用(约64.22%),其中A类载体占50.62%,非A类载体占13.60%,非Na+依赖载体起次要作用(35.78%)
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shRNA干扰ASCT2基因表达对结肠癌细胞生物学行为的影响
目的 探讨shRNA下调谷氨酰胺转运体ASCT2对结肠癌细胞Lovo和SW480生物学行为的影响.方法 利用Lipofectamine 2000介导ASCT2-shRNA的表达载体转染结肠癌细胞Lovo和SW480,通过反转录PCR和western blot分别检测转染后ASCT2 mRNA及蛋白的表达情况;分别应用MTT法和transwell法检测其结肠癌细胞增殖和侵袭能力;应用放射示踪法检测结肠癌细胞对谷氨酰胺的摄取情况.结果 shASCT2转染后,Lovo和SW480细胞中ASCT2 mRNA及蛋白水平均显著下调(P＜0.01).shASCT2转染后,Lovo和SW480细胞增殖能力(A490)和细胞侵袭能力(透膜细胞数)均较对照组细胞显著减弱(均P＜0.01);其中Lovo细胞中实验组和对照组的透膜细胞数分别为46.3±5.9和197.7±9.1,SW480细胞中实验组和对照组的透膜细胞数分别为29.7±3.8和139.0±9.5.放射示踪法检测显示,shASCT2转染后,Lovo和SW480细胞对谷氨酰胺的摄取受到显著抑制,其中,对Lovo细胞的抑制率为79.15％,对SW480的抑制率为67.22％,差异均有统计学意义(均P＜ 0.01).结论 ASCT2在结肠癌中发挥癌基因的作用,其促进结肠癌进展的机制可能与谷氨酰胺代谢有关,有望成为肿瘤代谢治疗的重要靶点.
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正常妊娠和子痫前期胎盘Syncytin表达差异探讨
[目的]探讨syncytin及其受体ASCT2在子痫前期(PE)和正常妊娠胎盘组织中的表达改变.[方法]纳入研究病人共37例,分为2组,PE组21例,正常对照组16例,采用定量RT-PCR方法检测syncytin及ASCT2 mRNA的转录水平,Western blot法测定syncytin蛋白表达强度,比较两组较检测结果.[结果]两组均检测到syneytin mRNA、syncytin蛋白及ASCT2 mRNA,PE组胎盘syncytin mRNA水平(1.5±1.4)和蛋白表达强度(55.7±26.1)明显低于正常对照组(6.2±3.0,92.2±36.4,P＜0.01),ASCT2 mRNA水平无明显差异(P0.05).[结论]胎盘组织syncytin表达下调与PE发病密切相关,其受体ASCT2与PE发生无相关性.
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