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细胞衰老相关热点基因研究现状
机体衰老的本质是细胞衰老,细胞衰老受环境和基因网络调控,探索衰老相关的基因一直是人类抗衰老研究的重点之一.在众多的细胞衰老相关基因研究中,影响力比较大的有端粒学说、RecQ DNA解旋酶家族和去乙酰化酶沉默信息调节因子(SIRT)家族等,现对国内外关于细胞衰老相关基因新研究结果并简述如下.
关键词： 衰老 端粒 沉默信息调节蛋白质类 -
调控沉默信息调节因子2同系物1活性对脑缺血大鼠血管发生的影响
目的 探讨调控沉默信息调节因子2同系物1(SIRT1)活性对脑缺血大鼠血管发生的影响及其相关机制.方法 将120只清洁级健康雄性SD大鼠,采用随机数字表法随机分为4组:假手术组、脑缺血再灌注损伤模型组(模型组)、SIRT1激动剂组(激动剂组)和SIRT1抑制剂组(抑制剂组),每组大鼠各30只.用线栓法制作短暂性大脑中动脉栓塞模型;恢复血流再灌注24 h,对大鼠进行神经功能评分;氯化三苯基四氮唑染色法测定大鼠脑梗死面积;ELISA法检测缺血脑组织SIRT1去乙酰化酶活性;免疫组织化学法检测缺血脑皮质区CD34表达和微血管密度(MVD)计数;蛋白质印迹法检测缺血脑组织SIRT1、血管内皮生长因子(VEGF)和促红细胞生成素(EPO)蛋白伪表达水平.结果 模型组缺血脑组织SIRT1去乙酰化酶活性为(7.721±0.581)U/L,较假手术组[(13.828±0.828)U/L]显著降低(t=8.650,P<0.01);激动剂组缺血脑SIRT1去乙酰化酶活性为(26.165±0.971)U/L,较模型组显著升高(t=-26.123,P<0.01);抑制剂组缺血脑SIRT1去乙酰化酶活性(17.094±1.012)U/L,较激动剂组显著降低(t=12.848,P<0.01).大鼠缺血脑组织SIRT1被激活后,其神经功能缺损评分[(1.333±0.516)分]较模型组[(2.667±0.516)分]明显降低(t=4.822,P<0.01);抑制SIRT1活性后,其神经功能缺损评分[(2.500±0.548)分]较激动剂组显著升高(t=-4.147,P<0.01).模型组脑梗死面积为15.473％±3.049％,激活缺血脑组织SIRT1后,脑梗死面积(9.152％±1.803％)明显缩小(t=3.188,P<0.05).免疫组织化学结果显示缺血脑皮质区染成棕色的细胞为CD34染色阳性细胞;激活SIRT1可使缺血脑皮质区MVD计数显著增加[激动剂组MVD计数:每高倍镜下(8.167±1.941)个,模型组MVD计数:每高倍镜下(3.167±0.753)个,t=-6.864,P<0.01].免疫印迹结果表明,激活缺血脑组织SIRT1后,缺血脑组织中VEGF(激动剂组:0.568±0.012,模型组:0.468±0.008;t=-11.034,P<0.01)和EPO(激动剂组:0.646±0.010,模型组:0.471±0.013;t=-20.952,P<0.01)表达明显增加.结论 激活SIRT1对脑缺血大鼠有神经保护作用,机制可能与促进缺血脑组织中VEGF、EPO表达,增加缺血再灌注早期血管发生有关.
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SIRT1基因沉默在辐射诱导的NLRP3和IL-1β表达中的作用研究
目的 研究沉默信息调节因子1 (SIRT1)基因沉默对间充质干细胞(MSCs)受照后Nod样受体蛋白3(NLRP3)和IL-1β表达的影响,探讨SIRT1激活剂——白藜芦醇的辐射防护作用及其机理.方法 将MSCs分为空白对照组、单纯照射组、RNA干扰组、白藜芦醇组和RNA干扰+白藜芦醇组.采用酶联免疫吸附测定、Western blot和RT-PCR等方法检测IL-1β、SIRT1和NLRP3在蛋白和mRNA水平的表达.结果 辐射可导致MSCs细胞外IL-1β分泌水平明显升高,给予白藜芦醇后,细胞IL-1β分泌水平较单纯照射组显著下降(t=21.68,P＜0.01),NLRP3和IL-1β mRNA水平较单纯照射组明显降低(t=14.44,P＜0.01;t=12.35,P＜0.01),SIRT1基因沉默后,NLRP3和IL-1β的mRNA水平回升至单纯照射组水平(t=14.86,P＜0.01;t=11.12,P＜0.01),即使再给予白藜芦醇,NLRP3和IL-1β的mRNA水平仍明显高于白藜芦醇组(t=11.31,P＜0.01;t=10.54,P＜0.01).结论 SIRT1基因沉默减弱了白藜芦醇对辐射诱导的NLRP3和IL-1β的抑制作用,说明白藜芦醇可能通过激活SIRT1、抑制NLRP3、降低IL-1β的表达,从而减轻辐射引起的细胞损伤.
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SIRT1及其选择性剪接变异体SIRT1-ΔExon8在293T细胞衰老模型中的作用研究
目的：通过观察SIRT1全长（SIRT1-FL）及缺失第8外显子的SIRT1选择性剪接变异体（SIRT1-ΔExon8）在D-半乳糖诱导的293T细胞衰老模型中的表达变化，初步探讨SIRT1全长及SIRT1-ΔExon8对细胞衰老进程的影响。方法①细胞计数kit-8（CCK8）法测定不同浓度D-半乳糖（0，5，10，15，20 g/L）对293T细胞活力的影响。②用含10 g/L的D-半乳糖达氏修正伊氏培养基作用于第3代293T细胞，继续培养至第6代，建立细胞衰老模型，β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色观察衰老细胞阳性率。③实时聚合酶链反应（RT-PCR）检测诱导组与对照组细胞中SIRT1-FL及SIRT1-ΔExon8 mRNA的表达水平。结果①CCK-8结果显示10 g/L的D-半乳糖能诱导细胞衰老且不引起细胞过度损伤。②诱导组衰老细胞阳性率（74.2±3.6）％高于对照组（7.7±1.4）％（P＜0.05）。③RT-PCR结果显示诱导组SIRT1-FL和SIRT1-ΔExon8 mRNA表达水平分别较对照组降低了（78.26±0.05）％和（88.03±0.03）％（P＜0.05）。结论①SA-β-gal染色结果提示D-半乳糖诱导293T细胞衰老模型建立成功。②衰老细胞组的SIRT1-FL和SIRT1-ΔExon8mRNA表达水平较对照组均显著降低，提示SIRT1-FL及SIRT1-ΔExon8可能参与调控细胞衰老的进程。
关键词： 沉默信息调节蛋白质类 细胞衰老 半乳糖 -
SIRT1在急性肾损伤中的研究进展
SIRT1在肾脏保护方面发挥着重要的作用,它不仅能提高肾脏对急性应激的抵抗力,而且也参与能量代谢的调节,对原发性肾小球疾病、糖尿病肾病、急性肾损伤等均有重要意义.本篇文章针对SIRT1在不同原因导致的急性肾损伤中发挥的肾保护作用作一综述.
关键词： 肾疾病 急性病 沉默信息调节蛋白质类 酿酒酵母 -
SIRT1在肾脏的相关研究进展
沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1),哺乳动物sirtuins家族中的一种去乙酰化酶,对组蛋白及多种细胞转录调控因子具有非常重要的作用,可参与细胞凋亡、代谢、线粒体生物合成、自噬等过程的调节,并在多种疾病,如神经退行性变,心血管疾病,代谢性疾病,肿瘤以及衰老相关性疾病中发挥保护作用.随着SIRT1在肾脏领域研究的不断深入,其在肾脏生理病理过程中的作用日益受到关注,SIRT1有望成为肾脏疾病的潜在治疗靶点.
关键词： 沉默信息调节蛋白质类 酿酒酵母/代谢 肾/代谢 综述 -
白藜芦醇对细菌脂多糖耐受的THP-1细胞TNF-α启动子区的影响
目的:探讨白藜芦醇对细菌脂多糖(LPS)耐受的人原单核细胞THP-1细胞中TNF-α启动子区的影响.方法:首先建立LPS耐受THP-1细胞模型后,然后用LPS分别刺激正常THP-1细胞(对照组)、LPS耐受THP-1细胞(耐受组)、白藜芦醇处理的LPS耐受THP-1细胞(耐受+白藜芦醇组),检测各组细胞TNF-α mRNA的表达及TNF-α启动子区各转录因子的结合情况.结果:LPS刺激后,TNF-α mRNA表达在对照组细胞迅速升高,耐受组缓慢升高,而耐受+白藜芦醇组略微升高,表达量明显低于前两组(均P＜0.05).染色体免疫沉淀(ChIP)分析显示,LPS刺激前,耐受组与耐受+白藜芦醇组p65及乙酰化p65 (ace-p65)、RelB、G9a对TNF-p启动子区的结合量均明显高于对照组(均P＜0.05),而p50的结合量各组细胞间无统计学差异(P＞0.05);LPS刺激后,p65和ace-p65对TNF-α启动子区的结合量在对照组明显增加,而在耐受+白藜芦醇组明显降低,G9a结合量在对照组量明显降低(均P＜0.05),其余转录因子较刺激前无明显改变(均P＞0.05).结论:白藜芦醇可以抑制LPS耐受的THP-1细胞中TNF-α mRNA的表达,可能部分通过抑制p65/ace-p65对TNF-α启动子区的结合,因此可考虑将白藜芦醇用于治疗脓毒症的辅助治疗.
关键词： 脓毒症 沉默信息调节蛋白质类 白藜芦醇 脂多糖类 -
靶向大鼠沉默信息调节因子1基因小干扰RNA慢病毒载体对大鼠视网膜神经节细胞中沉默信息调节因子1表达的影响
目的 观察靶向大鼠沉默信息调节因子1(Sirt1)基因的小干扰(si)RNA慢病毒载体对大鼠视网膜神经节细胞(RGC)中Sirt1表达的影响.方法 设计4条靶向大鼠Sirt1基因的siRNA靶点序列,构建靶向大鼠Sirt1基因的siRNA慢病毒载体.采用菌落聚合酶链反应(PCR)和DNA测序鉴定阳性克隆.应用阳性重组质粒与包装质粒共转染293T细胞,进行慢病毒包装及病毒滴度测定.将RGC分为空白对照组、转染阴性对照病毒载体组(NC组)以及分别转染4个带有干扰序列的si-Sirt1-1组、si-Sirt1-2组、si-Sirt1-3组、si-Sirt1-4组.采用荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测各组RGC中Sirt1 mRNA、蛋白相对表达量.结果 菌落PCR鉴定和DNA测序结果显示,靶向大鼠Sirt1基因的siRNA慢病毒载体构建成功.在293T细胞中成功包装后,其病毒滴度为8×108 TU/ml.荧光定量PCR和Western blot检测结果显示,与NC组比较,si-Sirt1-1组、si-Sirt1-2组、si-Sirt1-3组、si-Sirt1-4组RGC中Sirt1 mRNA、蛋白相对表达量均明显下降,差异有统计学意义(F=27.682、1185.206,P=0.000、0.000);其中,以si-Sirt1-2组Sirt1 mRNA、蛋白相对表达量下降幅度为明显.结论 靶向大鼠Sirt1基因的siRNA慢病毒载体可降低大鼠RGC中sirt1 mRNA、蛋白表达.
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沉默信息调节因子1慢病毒表达载体的构建及其在视网膜神经节细胞中的表达
目的 构建沉默信息调节因子1(sirt1)过表达慢病毒载体,观察其在体外培养的视网膜神经节细胞(RGC)中的表达.方法 构建大鼠sirt1 cDNA的过表达慢病毒载体,采用PCR鉴定其是否构建成功.同时将其与GenBank上sirt1 cDNA标准序列进行对比分析.将鉴定后的慢病毒重组表达质粒pLV5-sirt1与包装质粒共转染293T细胞,制备携带sirt1的慢病毒pLV5-sirt1.体外培养Sprague-Dawley大鼠的RGC,应用pLV5-sirt1感染细胞设为sirt1过表达慢病毒组,同时设未感染组和空载体感染组.采用荧光显微镜观察细胞感染效率,实时PCR和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测sirt1 mRNA和蛋白表达水平.结果 PCR鉴定结果显示,在1680碱基对处有扩增条带,表达的DNA条带与sirt1目的片段大小一致.与GenBank上sirt1cDNA标准序列进行对比分析,测序结果显示其含有与设计相同的靶序列.荧光显微镜观察发现,空载体感染组和sirt1过表达慢病毒组均可看到绿色荧光,感染效率在90％以上.实时PCR检测结果显示,sirt1过表达慢病毒组sirt1 mRNA表达水平较未感染组、空载体感染组均明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05).Western blot检测结果显示,sirt1过表达慢病毒组sirt1蛋白表达水平较未感染组、空载体感染组均明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 成功构建的大鼠sirt1过表达慢病毒载体能够在体外有效感染大鼠RGC,提高sirt1在RGC中的表达水平.
