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氯沙坦抑制高糖及间歇性高糖诱导INS-1细胞内质网应激作用
目的 探讨氯沙坦对高糖及间歇性高糖诱导大鼠胰岛β细胞株INS-1细胞内质网应激的抑制作用. 方法 各种刺激作用96h后,MTT法检测空白(Con)组、正常葡萄糖(NG)组、高糖(HG)组、间歇性高糖(MG)组、氯沙坦(LT)组、氯沙坦高糖(LT+ HG)组及氯沙坦间歇性高糖(LT+MG)组的细胞活力；免疫印迹检测内质网标记物糖调节蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、Caspase-12及磷酸化C-Jun氨基末端激酶(p-JNK)在INS-1细胞的表达；AnnexinV检测细胞凋亡；细胞活性氧(ROS)含量应用CM2 H2DCFDA试剂盒检测. 结果 与Con组及NG组相比,高糖及间歇性高糖抑制细胞活性、凋亡率升高(P均＜0.01),同时上调GRP78、CHOP、Caspase-12及p-JNK表达(P均＜0.01),ROS含量上升(P均＜0.01).MG组细胞活性低于HG组(P＜0.01),凋亡率、ROS含量以及GRP78、Caspase-12、p-JNK的表达均高于HG组(P＜0.05或P＜0.01).氯沙坦能抑制高糖及间歇性高糖诱导的细胞凋亡及ROS产生(P均＜0.01),同时抑制GRP78、CHOP、Caspase-12及p-JNK的表达上调(P均＜0.01).结论 氯沙坦可通过抑制高糖及间歇性高糖诱导INS-1细胞内质网应激作用从而减少细胞凋亡.
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间歇性高糖对大鼠胰岛细胞瘤细胞系Ins-1的损伤作用及对第10号染色体缺失的张力同源性磷酸酶表达的影响
目的 探讨间歇性高糖对大鼠胰岛细胞瘤细胞系Ins-1的损伤作用及对第10号染色体缺失的张力同源性磷酸酶(PTEN)表达的影响.方法 将Ins-1细胞分为正常组(CG组,11.1 mmol/L葡萄糖培养)、持续高糖组(SHG组,33.3 mmol/L葡萄糖培养)、间歇性高糖组(IHG组,11.1 mmol/L及33.3 mmol/L葡萄糖交替培养12h),3组细胞均培养3d.欧文比色法(MTS)测定细胞增殖活性,膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V/PI)双染细胞后,以流式细胞仪测定各组细胞的凋亡率,放免法测各组细胞胰岛素分泌,2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)荧光探针测定各组细胞内活性氧簇(ROS)水平,倒置相差显微镜下观察各组细胞形态,钙离子荧光探针法(Fluo 3-AM)测定细胞内钙离子浓度,Western blotting法测定各组细胞PTEN蛋白表达.各组内均数比较采用单因素方差分析.结果 SHG组细胞凋亡率、细胞内ROS水平、细胞内钙离子浓度及PTEN表达均较CG组显著增加(t=8.310、10.261、17.890、5.123,均P＜0.05),细胞增殖活性、胰岛素分泌均较CG组显著降低(t=-19.630、-2.053,均P＜0.05).IHG组细胞凋亡率、细胞内ROS水平以及钙离子浓度及PTEN表达均较CG组及SHG显著增加(t=6.200～18.227,均P＜0.05),细胞增殖活性、胰岛素分泌均较CG组及SHG组均显著降低(t=-27.800、-2.790、-8.167、-1.503,均P＜0.05).IHG组较SHG组及CG组Ins-1细胞异型性明显、细胞数量显著减少且排列紊乱.结论 氧化应激参与高糖对Ins-1细胞的损伤作用,可能与PTEN表达增高有关,间歇性高糖对INS-1细胞的损伤作用较持续性高糖严重.
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沉默钙非依赖型磷脂酶A2β基因对间歇性高糖诱导胰岛微血管内皮细胞凋亡的影响
目的 通过小分子干扰(siRNA)技术沉默大鼠胰岛微血管内皮细胞(IMECs)的钙非依赖型磷脂酶A2(iPLA2)基因,研究不同葡萄糖浓度对IMECs iPLA2表达的影响及其与细胞凋亡之间的关系.方法 通过分离纯化大鼠胰岛,获取IMECs细胞,采用随机数余数分组法将其分为正常糖组(5 mmol/L)、恒定高糖组(28 mmol/L)及间歇高糖组(每24小时轮换培养于5mmol/L或28 mmol/L葡萄糖);通过实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测葡萄糖浓度分别为恒定的5 mmol/L、28 mmol/L以及每24小时轮换的5 mmol/L或28 mmol/L培养条件下的IMECs iPLA2的基因表达;合成iPLA2的RNA干扰序列并转染至IMECs中,通过RT-PCR验证其是否转染成功;采用细胞DNA片段化检测和膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V/PI)流式细胞仪检测不同葡萄糖浓度条件下IMECs的凋亡.组间两两比较采用LSD检验,凋亡率采用随机区组设计的两因素ANOVA分析.结果 RT-PCR检测显示各组细胞iPLA2基因表达逐渐减弱,依次为1.90±0.23、0.90±0.05及0.23±0.03,且各组间差异有统计学意义(P＜0.05).成功合成并转染iPLA2 siRNA后,IMECs间歇性葡萄糖培养组较正常糖组及恒定高糖组DNA片段化更为明显,间歇高糖组流式细胞凋亡率较正常糖组升高,差异有统计学意义(44.9±2.7比3.1±1.0,P＜0.05).结论 间歇性高糖环境可抑制IMECsiPIA2基因表达,且通过小分子干扰技术抑制iPLA2基因表达能够促进细胞的凋亡,提示iPLA2表达减弱可能参与了间歇性高糖诱导的IMECs凋亡过程.
关键词： 胰岛微血管内皮细胞 间歇性高糖 钙非依赖型磷脂酶A2 凋亡 -
间歇性高糖对胰岛微血管内皮细胞凋亡和氧化应激损伤的影响
目的 探讨间歇性高糖对胰岛微血管内皮细胞凋亡和氧化应激损伤的影响.方法 以体外不同葡萄糖浓度DMEM培养基培养的大鼠胰岛微血管内皮细胞为研究对象,分为正常葡萄糖组、恒定性高糖组和间歇性高糖组,连续培养7 d.采用DNA片段化检测及流式细胞仪测定胰岛微血管内皮细胞的凋亡,连续光谱荧光仪检测细胞凋亡蛋白酶Caspase-3活性.通过测定细胞活性氧族水平、线粒体膜电位及黄嘌呤氧化酶评估不同培养条件下对胰岛微血管内皮细胞氧化应激的影响.结果 间歇性高糖组较正常葡萄糖组和恒定性高糖组的细胞凋亡明显增多,差异具有统计学意义(P<0.001);间歇性高糖组细胞内活性氧簇、黄嘌呤氧化酶水平显著高于恒定性高糖组和正常葡萄糖组差异具有统计学意义(P<0.001).间歇性高糖组线粒体膜电位水平显著低于恒定性高糖组和正常葡萄糖组差异具有统计学意义(P<0.001).结论 间歇性高糖较恒定性高糖能够促进胰岛微血管内皮细胞氧化应激损伤及增加细胞凋亡.
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艾塞那肽对间歇性高糖环境下胰岛INS-1细胞的保护作用
目的 评价间歇性高糖对胰岛β细胞的损害及艾塞那肽( Exenatide)的保护作用.方法 取大鼠胰岛INS-1细胞分为5组;正常糖(5.5mmol/L)对照组、恒定性高糖(30mmol/L)组和恒定性高糖+Exenatide(100nmol/L)组按分组所述对细胞进行培养,间歇性高糖组和间歇性高糖+Exenatide组采用高糖与正常糖交替(每24h更替1次)培养细胞.培养7d后检测各组细胞内活性氧自由基(ROS)和黄嘌呤氧化酶(XOD)水平,同时检测细胞增殖和凋亡情况.结果 与正常糖对照组比较,恒定性高糖组及间歇性高糖组细胞内ROS、XOD水平和细胞凋亡率明显增加(P<0.04),细胞增殖活性明显降低(P<0.01),尤以间歇性高糖组更为明显.恒定性高糖+Exenatide组的ROS、XOD水平和细胞凋亡率明显低于恒定性高糖组(P<0.05),而间歇性高糖+Exenatide组明显低于间歇性高糖组(P<0.01);恒定性高糖+Exenatide组和间歇性高糖+Exenatide组的细胞增殖活性与正常糖对照组无统计学差异.结论 间歇性高糖和恒定性高糖均能增加大鼠INS-1细胞内氧化应激水平,从而促进细胞凋亡、抑制细胞增殖,尤以间歇性高糖更为明显;Ex-enatide可显著减轻高糖对细胞的损害.
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艾塞那肽对间歇性高糖下INS-1细胞周期及细胞周期蛋白影响
目的：探讨艾塞那肽（Exenatide）对间歇性高糖影响胰岛素瘤细胞INS-1细胞周期进程的相关蛋白的作用，了解其干预细胞增殖变化的有关分子机制。方法实验分为5组：正常糖组，即培养于葡萄糖浓度5.5 mmol/L的RPMI-1640（1640培养液）完全培养液；恒定性高糖组，培养于葡萄糖浓度30 mmol/L的RPMI-1640完全培养液；间歇性高糖组，即每24 h轮换培养于葡萄糖浓度5.5 mmol/L或30.0 mmol/L的RPMI-1640完全培养液；恒定性高糖+艾塞那肽组，培养液含葡糖糖浓度30.0 mmol/L并加入终浓度为100.0 nmol/L艾塞那肽；间歇性高糖+艾塞那肽组，间歇性高糖的基础上加入终浓度为100.0 nmol/L艾塞那肽。各组细胞在37℃、体积分数5%CO2条件下培养7 d。细胞增殖活性8试剂盒检测细胞增殖活性，碘化丙啶染色及流式细胞仪检测细胞周期。Western blot检测细胞周期素D1（cyclin D1）、p21蛋白表达情况。结果恒定性高糖+艾塞那肽组及间歇性高糖+艾塞那肽组细胞增殖活性与正常糖组相比无统计学意义，但高于恒定性高糖组及间歇性高糖组[5组间差异有统计学意义（F=3026，P=0.000）]。恒定性高糖+艾塞那肽组（49.12%±3.72%）和间歇性高糖+艾塞那肽组（49.73%±4.04%）的G0/G1细胞周期分布与正常糖组（48.75%±3.11%）相比，差异无统计学意义，但低于恒定性高糖组（56.54%±3.50%）及间歇性高糖组（65.54%±3.63%）（F=20.054，P=0.000）。恒定性高糖+艾塞那肽组（0.41±0.02）及间歇性高糖+艾塞那肽组（0.43±0.07）cyclin D1表达水平与正常糖组（0.46±0.03）无差异，但明显高于恒定性高糖组（0.31±0.02）及间歇性高糖组（0.18±0.03）（F=29.284，P=0.000）。恒定性高糖+艾塞那肽组（0.21±0.05）及间歇性高糖+艾塞那肽组（0.22±0.03） p21表达水平与正常糖组（0.19±0.05）无差异，但明显低于恒定性高糖组（0.40±0.03）及间歇性高糖组（0.51±0.04）（F=40.296，P=0.000）。结论艾塞那肽使在间歇性或恒定性高糖条件下，INS-1细胞周期进程正性调控蛋白cyclin D1的表达水平升高，并减少细胞周期抑制性的蛋白p21的表达水平，这一变化可能有利于减轻间歇性及恒定性高糖对INS-1细胞周期的阻滞效应，从而促进了细胞周期进程，增强了INS-1细胞的增殖活性。
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间歇性高糖对NRK-52E细胞抗氧化能力作用研究
目的 探讨间歇性高糖抑制大鼠肾小管导管上皮细胞株NRK-52E抗氧化能力.方法 实验开始72 h后,Western blot检测空白组、正常葡萄糖组(5 mmol/L葡萄糖)、高糖干预组(25 nmol/L葡萄糖)、间歇性高糖干预组(5 mmol/L葡萄糖与25 mmol/L葡萄糖交替)中氧化物歧化酶-1(SOD-1)、还原型辅酶Ⅱ(NADPH)在NRK-52E细胞表达.一氧化氮合酶(eNOS)试剂盒应用液闪仪测定3[H]的放射强度,活性氧(ROS)含量应用CM2H2DCFDA试剂盒检测.结果 高浓度葡萄糖及间歇性高糖均下调SOD-1及NADPH表达,而提高ROS含量,间歇性高糖作用更显著.间歇性高糖eNOS含量低于持续性高糖组.结论 间歇性高糖抑制肾小管导管上皮细胞抗氧化能力显著.
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间歇性高糖对胰岛β细胞生长及细胞周期进程的影响
背景:间歇性高糖可阻滞胰岛β细胞生长,增加β细胞的凋亡,但具体作用机制尚不清.目的:观察间歇性高糖对大鼠胰岛素细胞增殖、凋亡及对细胞周期进程的影响.方法:实验对大鼠胰岛素细胞进行培养,分为正常糖对照组,恒定性高糖组和间歇性高糖组,分别含葡萄糖5.5,30,30和5.5 mmol/L间歇换液.采用细胞计数试剂盒检测细胞增殖活性,流式细胞仪测定细胞周期,Annexin-V/PI双标流式细胞术检测细胞凋亡,应用Western blot检测细胞周期调控蛋白Cyclin D1的表达水平.结果与结论:与正常糖对照组相比,恒定性高糖组及间歇性高糖组均明显抑制大鼠胰岛素细胞细胞的生长(P < 0.01),增加大鼠胰岛素细胞的凋亡(P < 0.01),明显抑制细胞周期进程,使大鼠胰岛素细胞的细胞周期更多滞留在G0/G1期(P < 0.01),能显著减弱细胞周期调控蛋白Cyclin D1的表达(P < 0.01).与恒定性高糖组相比,间歇性高糖以上各指标作用均更显著(P < 0.01).结果证实,间歇性高糖能够抑制大鼠胰岛素细胞的生长,增殖和诱导凋亡,其机制可能是通过降低Cyclin D1的活性,使细胞阻滞在G0/G1期,抑制细胞周期进程,从而减弱细胞的增殖活性.
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丹酚酸B对间歇性高糖诱导的JNK活化和INS-1细胞凋亡的影响
目的观察丹酚酸B（Salvianolic acid B，Sal B）对间歇性高糖诱导的大鼠胰岛素瘤细胞（INS-1）c-Jun氨基末端激酶（JNK）活化和细胞凋亡的影响。方法 INS-1细胞与丹酚酸B预孵24 h后暴露于间歇性高糖（11.1 mmol·L－112 h，33.3 mmol·L－112 h）72 h。MTT法测定细胞活力，ELISA 法测定葡萄糖刺激的胰岛素分泌能力，荧光探针DCFH-DA检测细胞内活性氧（ROS）水平，流式细胞术检测细胞凋亡水平，Western blot法检测胰十二指肠同源盒-1（PDX-1）蛋白表达和JNK活化水平。结果丹酚酸B可明显减轻间歇性高糖诱导的INS-1细胞损伤和凋亡（P＜0.05，P＜0.01），提高葡萄糖刺激的胰岛素分泌能力（P＜0.05，P＜0.01）；与丹酚酸B预孵可明显降低细胞内ROS水平、抑制JNK活化，并提高PDX-1蛋白表达水平（P＜0.05，P＜0.01）。结论丹酚酸B可有效减轻间歇性高糖诱导的INS-1细胞损伤和凋亡，提高胰岛素分泌水平，其机制可能与降低细胞内ROS水平、抑制JNK活化和上调PDX-1蛋白表达有关。
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间歇性高糖对大鼠肾小管上皮细胞NRK-52EA转分化的影响
目的:探讨间歇性高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞株NRK-52EA转分化干预作用.方珐:NRK-52E细胞分为空白组、正常葡萄糖组、高糖组、间歇性高糖组,分别作用72 h后,Western blot检测转化生长因子β1(TGF-β1)、Ⅰ型胶原、金属蛋白酶-2(MMP-2)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)以及甲状旁腺素相关肽(PTHrP)的表达;CM2H2DCFDA试剂盒检测活性氧(ROS)含量.结果:高糖组及间歇性高糖组NRK-52E细胞TGF-β1、Ⅰ型胶原、MMP2、α-SMA以及PTHrP表达均上调;间歇性高糖组TGF-β1、MMP2以及α-SMA表达水平较高糖组高(P均<0.05),其ROS含量也显著高于高糖组(P<0.01).结论:间歇性高糖能通过氧化应激诱导肾小管导管上皮细胞表达TGF-β1、MMP2,并促进NRK-52EA细胞转分化为α-SMA细胞.
关键词： 间歇性高糖 NRK-52EA细胞 转分化
