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应用基因表达谱芯片技术筛选HCV p7蛋白反式调节基因
目的 应用基因芯片技术对pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(-)-p7分别转染的HepG2 细胞的基因表达谱进行分析,筛选能被HCV p7蛋白反式调节的靶基因,研究p7蛋白的生物学功能.方法 以含有HCV全基因组的pBRTM质粒作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)扩增p7蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-p7.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果 构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误,提取高质量的总mRNA并逆转录成cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1152个基因表达谱的筛选中,有1个基因表达水平显著上调,22个基因表达水平显著下调.结论 HCV p7蛋白是一种反式调节因子,p7基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响.
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日本血吸虫P7蛋白基因的克隆及序列分析
目的 克隆、分析日本血吸虫P7蛋白(Sj P7)基因,为研究该基因编码蛋白在日本血吸虫病免疫诊断及预防中的作用奠定基础.方法 从日本血吸虫cDNA文库中用PCR法体外扩增出Sj P7蛋白基因,通过与线性克隆载体pGEM-T连接,经进行酶切和PCR鉴定及DNA测序证实和分析.结果 PCR法扩增出了一个大小约423bp左右的DNA片断,将重组质粒pGEM-T-Sj P7作BamH Ⅰ和XhoⅠ双酶切,均能得到一个大小与PCR扩增产物一致的插入片断,对插入片断的测序结果 表明,Sj P7具有一个长度为423bp的完整开放阅读框(ORF),编码140个氨基酸,理论分子量为20 kDa,与GenBank收录(编号为EU121231)的Sj P7基因具有高度的同源性(100%).结论 本实验成功地克隆了Sj P7编码基因,为进一步研究提供了条件.
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丙型肝炎病毒P7蛋白体外原核表达状况的研究
目的:扩增丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)P7蛋白基因,克隆到多个原核表达系统,观察P7蛋白在体外表达的情况,获取具有生物学活性的HCV P7重组蛋白.方法:设计扩增全长HCVP7基因片段的特异引物,以H/FL质粒DNA(含HCV 1acDNA全长序列)为模板,通过PCR扩增全长HCVP7基因,定向克隆到pQE30、pGEX 4T-2、pET32a(+)3种不同类型的原核表达载体中.将重组后包含HCVP7基因的原核表达载体转化表达型大肠杆菌BL21(DE3)pLysS或SG13009(PREP4),并做异丙基硫化-β-D-半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactoside,IPrG)诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定HCV P7蛋白原核表达的情况.结论:获得可溶性的重组蛋白GST-HCV P7和Trx-HCV P7,为进一步研究P7蛋白的生物学功能奠定基础.
